细菌菌落总数的测定

5.2x104 2.6x105
3.5x105
4
152
37
10-2，10-3
9.0x104
5 6
26 无法计数
12 568
5 312
10-2 10-4
2.6x103 3.1x106
4、若所有稀释度平板菌落数均<30， 则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍 数计算。
5、若所有稀释度平板均无菌落生长， 则应按<1乘以最低稀释倍数计算。
菌落总数主要作为判别食品被污染 程度的标志，也可以应用这一方法观察 细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检 样品进行卫生学评价时提供依据。
食品中细菌菌落总数越多，则食品 含有致病菌的可能性越大，食品质量越 差；菌落总数越小，则食品含有致病菌 的可能性越小。须配合大肠菌群和致病 菌的检验，才能对食品做出较全面的评 价。
食品微生物学检验 菌落总数的测定
一、 目的
1、 学习并掌握食品中菌落总数测定方 法和原理。 2 、了解菌落总数测定在对被样品进行 卫生学评价中的意义 。
二、原理
细菌数量的表示方法由于所采用的 计数方法不同而有两种：菌落总数和细 菌总数。
1、菌落总数 是指食品检样经过处理，在一定条 件下培养后，所得1g或1mL检样中形成 的细菌菌落总数。以 CFU/g（mL）来 表示。 一定条件包括培养基成分、培养温度 和时间、pH、是否需要氧气等。
3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计 数，则报告菌落蔓延。 4、 若空白对照上有菌落生长，则此次检 测结果无效。 5、称重取样以CFU/g 为单位报告，体积 取样以CFU/mL 为单位报告。
注意事项
1、无菌操作
操作中必须有“无菌操作”的概念，所用 玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子 等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装， 应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操 作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室 进行。
4、每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌பைடு நூலகம்吸管。 5、倾注用培养基应在46℃水浴内保温， 温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易 于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水 浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。
6、倾注培养基的量规定不一，从12～ 20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板 过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾 注时，培基底部如有沉淀物，应将底部 弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。
9、为了避免食品中的微小颗粒或培 基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易 分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混 合的平板，不经培养，而于4℃环境中放 臵，以便计数时作对照观察。
六、 结果
1、 将实验测出的样品数据以表格的 方式报告。 2 、对样品菌落总数作出是否符合卫 生要求的结论。
报告方式
样品 稀释液及 菌落数 选择稀 释度 报告(CFU/g,ml)
按国家标准方法规定，即在需氧情况 下， 36 ±1℃培养48±2 h，能在平板 计数琼脂上生长发育的细菌菌落总数。 所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求 的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件 不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
菌落总数并不表示实际中的所有细菌总 数，也不能区分其中细菌的种类，只包括 一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温 的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以 有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
例如：
稀释度 1:100（第一稀释度） 1:1000（第二稀释度） 菌落数 232，244 33，35
232+244+33+35 (2+0.1×2) ×10-2
=544/0.022=24727
四舍五入表示为: 2.5 × 104
试样 例次
稀释度 10-2 10-3 10-4 选定计数稀释度
菌量 /(个/g 或mL)
1 2
3
380
平 均 526 菌 落 435 数 284
52 205
210
18 32
48
10-3 10-3，10-4
10-3，10-4
5.2x104 2.6x105
3.5x105
4
152
37
10-2，10-3
9.0x104
5 6
26 无法计数
12 568
5 312
10-2 10-4
2.6x103 3.1x106
试样 例次
稀释度 10-2 10-3 10-4 选定计数稀释度
菌量 /(个/g 或mL)
1 2
3
380
平 均 526 菌 落 435 数 284
52 205
210
18 32
48
10-3 10-3，10-4
10-3，10-4
5.2x104 2.6x105
3.5x105
4
152
37
10-2，10-3
9.0x104
同时分别取1ml稀释液（不含样品） 加入两个灭菌平皿内作空白对照。
5 、稀释液移入平皿后，将冷却至 46℃琼脂培养基注入平皿约15～20ml， 并转动平皿，混合均匀。
6、 待琼脂凝固后，翻转平板，臵 36±1℃温箱内培养48±2h，水产品 30±1℃温箱内培养72±3h。 如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥 漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面 覆盖一薄层琼脂培养基（约4毫升），凝固 后培养。
（二） 菌落记录方法 做平板菌落数记录时，可用肉眼观察， 必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记 下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度 的各平板平均菌落数。 到达规定培养时间，应立即计数。如果 不能立即计数，应将平板放臵于0～4℃， 但不要超过24h。
1、 平皿菌落数的选择 选取菌落数在30～300之间的平板作 为菌落总数测定标准。每一个稀释度应 采用两个平皿，大于300的可记为多不 可计。
7、为使菌落能在平板上均匀分布， 检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并 旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样 从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时 间不宜超过20min，以防止细菌有所死 亡或繁殖。
8、培养温度一般为37℃（水产品的 培养温度，由于其生活环境水温较低， 故多采用30℃）。培养时间一般为48h， 有些方法只要求24h的培养即可计数。 培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培 养48h后，培养基失重不应超过15％。
2、用1 mL灭菌吸管吸取1:10稀释 液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL灭 菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内， 振摇试管或反复吹打混合均匀，制成 1:100的稀释液。
3 、另取1 mL灭菌吸管，按上项操 作顺序，制10倍递增稀释液，如此每 递增稀释一次即换用1支1 mL吸管。
4、根据标准要求或对污染情况的估 计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制 作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释 度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中， 每个稀释度做两个平皿。
大肠埃希氏菌cfu/100ml或MPN/100ml ：不得检出
《瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准》(GB 17324-2003) 细菌菌落总数cfu/ml： ≤20
大肠菌群MPN/100ml： ≤3
致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出
霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出
3、 若所有稀释度的平板菌落数均 >300，则取最高稀释度的平均菌落数乘 以稀释倍数计算。
试样 例次
稀释度 10-2 10-3 10-4 选定计数稀释度
菌量 /(个/g 或mL)
1 2
3
380
平 均 526 菌 落 435 数 284
52 205
210
18 32
48
10-3 10-3，10-4
10-3，10-4
5 6
26 无法计数
12 568
5 312
10-2 10-4
2.6x103 3.1x106
6、若所有稀释度均不在30～300之间， 有的>300，有的又<30，则应以最接近 300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
（四） 菌落计数报告方法
1、菌落数在1～100时，按四舍五入报 告两位有效数字。 2、菌落数≥ 100时，第三位数字按四舍 五入计算，取前面两位有效数字，为了缩 短数字后面的零数，也可以10的指数表示。
10-2 10-3 10-4
原始
计算公式
报告
样品 名称
数据
平均
七、思考 1、 什么是细菌菌落总数（cfu）？ 2、 影响杂菌总数准确性的因素有哪些？ 3、在食品卫生检验中，为什么要以细菌 菌落总数为指标？ 4、为什么营养琼脂培养基在使用前要保 持在46±1℃的温度？
酱油（GB/T2717-2003）： 细菌菌落总数： ≤30000 CFU/mL
2、采样的代表性 如系固体样品，取样时不应集中一 点，宜多采几个部位。固体样品必须经 过均质或研磨，液体样品须经过振摇， 以获得均匀稀释液。
3、稀释液
样品稀释液主要是灭菌生理盐水，或 磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后 者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保 护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油） 进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。
2、其中一个平板有较大片状菌落生 长时，则不宜采用，而应以无片状菌落 生长的平板作为该稀释度的菌落数；若 片状菌落不到平板的一半，而其余一半 中菌落分布又很均匀，则可以计算半个 平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。
3、当平板上有链状菌落生长时， 如呈链状生长的菌落之间无任何明显 界限，则应作为一个菌落计，如存在 有几条不同来源的链，则每条链均应 按一个菌落计算，不要把链上生长的 每一个菌落分开计数。
（三）菌落总数的计算
1、若只有一个稀释度平板上的菌落数在 适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的 平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数， 作为每g（mL）中菌落总数结果。
试样 例次
稀释度 10-2 10-3 10-4 选定计数稀释度
菌量 /(个/g 或mL)
1 2
3
380
平 均 526 菌 落 435 数 284
四、 流程
1、检样
2、做几个适当倍数的稀释液
3、选择2~3个适宜稀释度各1 mL,分别加入 灭菌平皿内 4、平皿内倾注15～20 mL琼脂培养基，混匀 5、36 ±1℃培养48±2小时或（24±2）小 时 6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量 7、 计算菌落总数 → 报告
五、 步骤
(一) 取样、稀释和培养 1、 以无菌操作取检样25g（mL），放于 225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 的灭菌玻 璃瓶内（瓶内预臵适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内， 经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。 固体和半固体检样在加入稀释液后，最好臵 灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理 1～2min，制成1:10的均匀稀释液。
2、细菌总数 指一定数量或面积的食品样品．经过 适当的处理后，在显微镜下对细菌进行 直接计数。其中包括各种活菌数和尚未 消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接 显微镜数。通常以1 g或1 mL样品中的细 菌总数来表示。
三 、 材料
1、 食品检样 2、 培养基 平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸 盐缓冲液 3、 其它 无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培 养箱等。
大肠菌群：
≤30MPN/100mL
肠道致病菌： 不得检出
全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999）：
特级
细菌菌落总数：≤20000
一级
≤30000 ≤90
二级
≤50000 ≤90
（CFU/ml）
大肠菌群 （MPN/100g） ≤40
肠道致病菌： 不得检出
不得检出 不得检出
巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）
细菌菌落总数： ≤30000 CFU/mL 大肠菌群： ≤90 MPN/100mL 肠道致病菌： 不得检出
生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）
菌落总数cfu/ml： ≤100 总大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml ：不得检出 耐热大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml ：不得检出
52 205
210
18 32
48
10-3 10-3，10-4
10-3，10-4
5.2x104 2.6x105
3.5x105
4
152
37
10-2，10-3
9.0x104
5 6
26 无法计数
12 568
5 312
10-2 10-4
2.6x103 3.1x106
2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计 数范围内时，按如下公式计算： N=∑C/（n1+0.1n2）d…………（1 ) 式中： N ― 样品中菌落数； ∑C ― 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落 数之和； nl ― 第一个适宜稀释度平板数； n2 ― 第二个适宜稀释度平板数； d ― 稀释因子（第一稀释度）。