1基因工程概论

基因工程概论连接产物●重组分子●未连接的载体分子●未连接的D N A片段●载体的自连●含有错误插入片段的重组D N A分子1转化—细菌吸收D N A的方式自然界中，转化并不是细菌获取遗传信息的主要方式。

细菌必须经过物理或化学处理后可提高吸收D N A的能力，经过这样处理的细菌称为感受态。

1.1大肠杆菌感受态的制备●感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

1.1大肠杆菌感受态的制备●在冷的盐溶液中转化效率提高。

一般利用50m M的C a C l2，或者氯化铷。

–原理：与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，并发生收缩，使细胞膜出现孔隙。

●42°C热激处理。

1.2筛选转化细胞1n g的p U C8可以产生1000-10000个转化子，意味着只吸收了0.01%的D N A分子。

1.3其他的转化方法●电穿孔驱动的完整细胞转化（电激转化法）●接合转化●微注射法●λ噬菌体的转染●P E G介导的细菌原生质体转化1.3其他的转化方法●电激转化–受体细胞在脉冲电场作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得D N A分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。

–可以转化较大的质粒，适用于所有的细菌。

1.3其他的转化方法●接合转化–是由接合型质粒完成的。

–涉及到三种菌株的混合：受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及含有待转化重组质粒的供体菌。

–重组质粒和接合质粒必须有相容性。

1.3其他的转化方法●P E G介导的细菌原生质体转化–高渗溶液中细菌培养至对数生长期–溶菌酶的等渗液处理，形成原生质体。

–加入D N A样品和聚乙二醇等渗液–离心除去聚乙二醇，固体培养。

●适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性菌、酵母、霉菌甚至植物。

表5-1大肠杆菌5种常用转化方法的比较2重组子的鉴定●利用插入失活选择p B R322重组●载体：含有β-半乳糖苷酶基因l a c Z的调控序列和头146个a a的编码序列●宿主：缺失了l a c Z’基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列●α-互补：l a c Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。

基因工程概论重点知识：遗传工程、基因工程的概念；基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现；基因工程的基本步骤；基因工程的意义。

难点知识：基因工程的概念；基因工程的基本步骤；基因工程的基本原理。

第二章基因工程的工具酶重点知识：同位酶；同裂酶；同尾酶；星号活力；DNA操作酶的功能及应用（Bal 31, E. coli外切酶III,S1核酸酶，DNase I,测序酶，DNA连接酶，DTD, Ligase,逆转录酶，碱性磷酸酯酶，甲基化酶）；限制性内切酶的分类、命名原则；电泳后DNA的检测方法；DNA分子量的估算方法；怎样提高平头末端的连接效率；如何实现目的基因与载体连接效率；提高重组率的方法；构建酶切图谱的方法。

难点知识：DNA操作酶的功能及应用；怎样提高平头末端的连接效率；如何实现目的基因与载体连接效率；提高重组率的方法；构建酶切图谱的方法。

第三章基因克隆的载体重点知识：载体；克隆载体；表达载体；穿梭载体；质粒；严谨型质粒松弛型质粒；cos位点；λ cI突变体；溶源/溶菌性噬菌体；粘粒（cosmid）；噬菌粒；2μm质粒；载体的基本要求；质粒的基本特征及其分类；λDNA的特点；M13作为载体的优点；如何测定DNA的浓度和纯度？质粒DNA的提取方法，纯化的原理与方法；噬菌体DNA的分离纯化方法；大肠杆菌质粒pBR322、pUC8、pGEM3Z-DNA的特点；不同载体克隆DNA的片段大小；M13、λDNA作为载体需要进行哪些改造？λ克隆载体的类型；建生物基因组文库需要克隆的数目；酵母克隆载体的类型；YAC载体包括那些结构，来源和构建方法。

难点知识：严谨型质粒松弛型质粒；粘粒（cosmid）；噬菌粒；M13、λDNA作为载体需要进行哪些改造？λ克隆载体的类型；建生物基因组文库需要克隆的数目；YAC载体包括那些结构，来源和构建方法第四章重组DNA的转化与筛选重点知识：感受态细胞；插入失活；α-互补；Spi+；转化的方法有哪些？转化效率如何；噬菌体DNA转化大肠杆菌的方法；重组噬菌斑的鉴定方法；重组DNA的鉴定方法。

复习题一、名词解释1. 原核基因（Prokaryotic gene）：由原核生物（如大肠杆菌）基因组编码的基因，以及高等生物细胞器线粒体基因组和叶绿体基因组等编码的基因，统称原核基因。

2. 真核基因（Eukaryotic gene）：真核生物基因组DNA编码的基因,以及感染真核细胞的DNA病毒和反转录病毒基因组编码的基因，统称真核基因。

3. .前导序列（Leader sequence）：又叫前导序列区或5'-非翻译区（5'-UTR），，系指位于mRNA5'-起始密码子之前的一段长数百个核苷酸的不翻译的RNA 区段。

4. 尾随序列（Tai1er sequence）：又称尾随序列区或3'-非翻译区（3'-UTR），系指位于mRNA3'-终止密码子之后一段100多核苷酸的不翻译的RNA区段。

5 复制子（Replicon）：指有一个复制起始区（oriC）和起始基因的DNA复制单元。

例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等，凡其DNA能够进行复制的遗传单元，均称复制子。

真核细胞基因组的复制子是指含有一个复制起始位点的DNA（RNA）的复制子特称复制单元。

6. 增强子（Enhancer）：又叫增强子序列或增强子元件，是真核基因中发现的一种特异序列，能够在距离目标基因50kb以上的位置，从上游或下游的不同位置及方向增强该基因的转录活性。

7. 沉默子（Silencer）在真核基因启动子中除了增强子之外，沉默子同样也是一种可远距离调控相关基因转录活性的顺式元件。

与增强子一样，沉默子也能够从启动子的上游、下游甚至是基因内部三种不同的位置以及正向或反向，影响相关基因启动子的转录起始效率。

同时沉默子往往是以组织特异性或时间特异的作用方式，控制基因的表达作用。

但与增强子的功能效应相反，沉默子只能抑制而不能激活相关基因的转录起始活性。

8. 绝缘子（Insulator）亦即是增强子活性的物理边界元件（physical boundaryelement），它是一段能够抑制或隔离增强子功能效应的顺式转录调节序列。

一、简述基因研究所取得主要成就，及其与基因工程创立与发展的关系。

1、基因学说的创立孟德尔提出遗传因子学说到后来的摩尔根染色体理论，揭示了在染色体上基因的线性排列。

2、DNA是遗传物质从Avery的细菌转化实验到沃森和克里克揭示了DNA的双螺旋模型及半保留复制机理，表明DNA是遗传物质。

3、DNA是基因的载体4、基因是细胞中RNA及蛋白质的“蓝图”。

5、随着中心法则的提出和64种密码子的破译，基因碱基顺序与蛋白质氨基酸顺序得到对应。

6、随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展，人们对基因的分子结构有了进一步的认识。

7、随着操纵子模型的提出，人们对基因的表达调控有了进一步的认识。

8、随着基因分离与克隆技术的不断改良与发展，基因组文库、cDNA文库、分子探针、PCR等技术不断被人们运用。

9、目前，不仅能够分离天然基因，还能结合化学合成等方法，在实验室内进行基因的合成、构建，并进行相应的表达分析。

基因工程是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上诞生的一门新兴学科，它的创立和发展，直接依赖于基因及其分子生物学研究的进步，基因及其研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础。

二、基因工程建立的三大理论基础和技术条件是什么？并简述其在基因工程中的应用。

1、三大理论基础：（1）1940年艾弗里（O.Avery）等人通过肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌；（2）1950年沃森（J.D.Watson）和克里克(F.Crick)发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理；（3）1960年关于遗传信息中心法则的确立。

2、三大技术条件：（1）限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现；（2）基因工程载体；（3）大肠杆菌转化体系的建立。

3、应用：通过限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以将切割得到的目的基因与载体连接在一起，经由大肠杆菌转化体系增值复制，为基因工程的后续研究提供基础材料。

基因工程的概述定义：狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因；广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。

如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品；将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。

基因工程又被称为基因拼接技术或者DNA重组技术，可分为微生物基因工程、动物基因工程和植物基因工程三种生物转基因技术。

其主要特点是通过人工转移的方式，将一种生物的基因转移到另外一个受体细胞中，并使该转移基因在受体细胞中表达，从而获得全新的具有生物活性的产物。

基因工程技术为遗传物质研究和医药研究提供了重要的技术支撑。

动物基因工程技术利用先进的生物技术手段对动物基因进行编辑和改造，以达到揭示基因功能和利用基因治疗疾病等目的。

常见的动物基因工程技术包括基因敲除、基因敲入、基因编辑和转基因技术等。

通过使用基因编辑工具精确地切割和删除目标基因的特定区域，使该基因在动物个体中的表达缺失，可以揭示该基因在特定生理过程中的功能和调控机制。

基因治疗能够通过修复或替换患有遗传性疾病的动物个体的缺陷基因来达到治疗和预防遗传疾病的目的。

如利用基因编辑技术可以修复猫头鹰视网膜变性等遗传性视网膜疾病，从而改善视力。

微生物具有结构简单、迅速繁殖的特性，在其繁殖发展中应用生物基因工程技术能取得显著的效果。

将外源基因转入微生物中表达，使微生物能够生产人所需要的产品，如抗体和药用蛋白质等。

利用基因工程技术开发的重组亚单位疫苗、重组活载体疫苗及基因疫苗，有利于打破传统疫苗的局限性。

植物细胞具有全能性，在特定环境下，植物组织或者细胞能够生长出完整的植株。

所以，可以将药物基因组合到植物细胞内，通过分别培养，得到具有药物基因的植株。

植物独特的稳定遗传特性为医药领域的发展提供了充足而良好的条件。

目前，借助植物基因工程制造的药物有纯化的血清蛋白、干扰素与脑啡肽等。