分子生物学实验2014解析

分子生物学实验
华中师范大学生命科学学院
实验目录
实验 一 植物基因组DNA提取及纯化 实验 二 PCR克隆目的基因 实验 三 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 实验 四 PCR产物凝胶回收 实验 五 目的基因片段与载体连接 实验 六 E.coli DH5α和 DE3感受态细胞制备 实验 七 连接产物转化转化大肠杆菌 实验 Fra Baidu bibliotek 阳性单菌落筛选 实验 九 重组质粒DNA提取 实验 十 重组质粒及表达载体pET酶切分析与电泳 实验十一 目的片段回收及与表达载体连接 实验十二 连接产物转化DH5α,质粒提取 实验十三 阳性质粒转化表达菌株BL21 实验十四 蛋白质的诱导表达及蛋白质样品制备 实验十五 SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白质
6. DNA的检测方法
（1）紫外分光光度法
（2）电泳检测DNA的质量
• 本实验是通过SDS法提取拟南芥基因组DNA。
二 实验目的
1.通过SDS提取拟南芥基因组DNA; 2.为从拟南芥基因组DNA克隆目的基因
作准备
仪器、材料和试剂
仪器及耗材： 研钵、微量移液器及吸头、EP 管、台式离心机。
材 料： 拟南芥小苗
试 剂： DNA Extract Buffer (0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5); 70%乙醇； 酚；氯仿；异丙醇;RNase
实验步骤
• 1. 取一定量的拟南芥组织; • 2. 加入600 μl抽提缓冲液（0.2M NaCl, 25mM EDTA,
0.5% SDS, pH 7.5），室温下快速研磨; • 3. 把抽提液从研钵中移至1.5 ml 离心管中，混匀; • 4. 12,000 rpm, 离心10 min (RT)。取上清，加等体积的
由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩 增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经 25-35 轮循环就可使DNA 扩增达待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR原理 FLASH演示
PCR技术发展
PCR是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩 增技术。
A260/A280=1.8，DNA纯度高。 A260/A280<1.7，有蛋白质的污染。 A260/A280>1.9,有RNA的污染或者降解。 A260/A230在2.0—2.5，DNA纯度高。 A260/A230<2.0,有糖类，盐类或者有机溶
剂污染。
注意事项
（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2）植物组织充分匀浆。 （3）DNA的二级结构和双链易受多种因素的影
醇，-20 ℃放置10min; • 13.12000rpm，4 ℃离心10min； • 14.去上清，70%乙醇洗涤沉淀,12000rpm，4 ℃离心
5min;
• 15.去上清，沉淀干燥后，加入20 μl ddH2O溶解DNA；
• 16.分光光度计法检测DNA的浓度和纯度。
实验报告分析
A260=1时相当于50 μg的双链DNA。
其干燥； • 8 加20 μl ddH2O溶解沉淀;
• 9.在溶解DNA中加入3-5 μl RNase，37℃消化2-3h；
• 10.补充ddH2O至总体积400 μl ，加入等体积的酚/氯仿，
混匀；
• 11.12000rpm，5min（RT）， • 12.取上清，加入1/10体积的乙酸钠和2倍体积的无水乙
响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避 免使用变性的条件。 （4）抑制内外源DNase的活力。 （5）防止化学降解。 （6）防止物理因素降解。。
思考题
• .1在拟南芥基因组提取缓冲液中，EDTA 和SDS的作用分别是什么？
实验二 PCR克隆目的基因
一 实验原理
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)是一种选择性体外 扩增DNA 的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(56℃左右)下与模板上 的目的序列通过氢键配对; (3) 延伸(Extension):在TaqDNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的 DNA 为模板进行合成.
酚/氯仿（1：1）混合液，上下颠倒混匀； • 5. 12,000 rpm, 5min (RT) ，取上清，加等体积的异丙醇，
上下颠倒混匀； • 6. 12,000 rpm, 10min (RT) ，弃上清，倒置于吸水纸上
待壁上液体流尽后加入1ml的70%乙醇洗沉淀； • 7. 12,000 rpm, 5 min (RT) ，弃上清，倒置于纸巾上待
实验一 植物基因组DNA提取
基本原理
1. 基因组DNA 的提取通常用于构建基因组文库、 Southern 杂交及PCR 分离基因等。 2.不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA 的提 取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其 细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。 3. 在提取某种特殊组织的DNA 时必须参照文献和经验 建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA 大分子。尤其 是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR 反应等 有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基 因组DNA 时, 应考虑除去多糖和酚类物质。
它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复 性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将 所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内 扩增至十万乃至百万倍。
PCR技术是生物科学领域中的一项革命性创举和 里程碑。
1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究 室的Mullis 等发明了具有划时代意义的 聚合酶链反应。
4.核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中 核酸通常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式 存在。核酸分为DNA和RNA，在真核生物中， 前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞 质和核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞 壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
5. 植物基因组DNA的提取程序：
（1）破碎组织 （2）破坏细胞膜 （3）去除杂质 （4）沉淀基因组DNA