实验两对半的检测ppt课件

5、洗涤：弃去反应条孔内液体，用洗涤液注満每孔，放置 或振荡1分钟，弃去拍干→反复5次（注意：最后一次一 定要拍干）
6、显色：每孔先加显色剂A 50ul，再加显色剂B 50ul，混 匀后置37°C水浴10分钟
7、中止显色：每孔加入中止液50ul
8、判断结果：
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①目测法：
•HBsAg， HBsAb， HBeAg
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什么是“乙肝二对半”？
“乙肝两对半”是指：表面抗原（HBsAg）、表
面抗体（HBsAb）、e抗原（ HBeAg ）、e抗体 （HBeAb）、核心抗体（HBcAb）
① HBsAg本身不具有传染性，只具有抗原性 ② 保护性抗体： HBsAb ③ 传染性指标： HBeAg ， HBcAg ④ HBeAb， HBcAb不是保护性抗体，而是反
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常见的检测模式（临床意义2）
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思考题
• sAg检测时，有哪些因素可能导致阴性对照 孔也出现颜色？
• 为什么建议用双波长比色。
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实验操作
1、加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别加入阴、阳对 照50ul。其余各孔为样品孔，各加入待测标本50ul（检 测HBcAb 时，待测标本需用稀释后的洗涤液做1：30稀 释）。
2、加中和试剂（只有检测HBeAb时才需要）：每孔50ul
3、加酶结合物：每孔50ul
4、温育：封板→充分混匀后置37°C水浴30分钟
HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2
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E EE
E
E
E
E EE
+
双抗体夹心法测抗原 -
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竞争抑制法测抗体
待测抗体
酶标
抗体 *
Anti-HBc Anti-HBe
包被抗原
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中和竞争法测抗体
* 酶标抗体
待测抗体 Anti-HBe
中和抗原
包被抗体
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试剂盒组成
映曾被HBV感染的重要指标。 7
为什么不检测核心抗原（HBcAg）
• HBcAg主要位于病毒颗粒中，只有少数游离。 • 机体免疫系统对HBcAg很敏感，易产生高滴度的
HBcAb,与HBcAg 形成免疫复合物。 • 血清中， HBcAg可丢失部分氨基酸。
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“乙肝二对半”的检测原理
• HBsAg：双抗体夹心法
ELISA检测“乙肝二对半”
(Enzyme linked immunosorbent Assay ELISA)
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酶 免
酶免疫组化
均相酶免疫测定
疫
技
酶免疫测定
非均相酶免疫测定
术
分
固
液பைடு நூலகம்
类
相
相
酶
酶
免
免
疫
疫
测
测
定
定
2
ELISA的概念
酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay，
• 操作简单、无需昂贵的仪器投入，价格便 宜。
• 对环境几乎没有污染。
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ELISA技术的应用
• 检测抗原的方法： • 检测抗体的方法：
• 双抗体夹心法 • 竞争法
• 双抗原夹心法 • 间接法 • 竞争法 • 捕获法
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实验目的
• 掌握ELISA法检测“乙肝二对半” 的原理、 操作步骤及注意事项。
• 掌握检测“乙肝二对半”的临床意义。
① 包被反应板：固相的抗原或抗体 ② 酶结合物：酶标记的抗原或抗体 ③ 显色剂：分A、B二瓶 ④ 终止液 ⑤ 对照：阳性对照，阴性对照 ⑥ 浓缩洗涤液 ⑦ 中和试剂（只有检测HBeAb的试剂盒才
有）
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实验准备
• 配制洗涤液：用蒸馏水按1：20稀释浓缩 洗涤液。
• 为节省试验时间，除检测核心抗体（HBcAb ）组外，其余组可在加样后的温育时间中才 配制洗涤液。
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•HBeAb ， HBcAb
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②比色法：波长450nm读取各孔OD值
• HBsAg， HBsAb， HBeAg 样品OD值/阴性对照OD值≥2.1 阳性
• HBeAb ， HBcAb 阴性对照OD值/样品OD值≥2.1 阳性
（建议双波长比色（450/630nm）；临界值的确定请参考实验
指导，不同的试剂盒和检测原理，临界值的设定均不同
• HBsAb：双抗原夹心法
• HBeAg：双抗体夹心法
• HBeAb：中和竞争法（血清中的e抗体与固相e抗体竞争结合e抗
原）
• HBcAb：竞争抑制法
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双抗原（体）夹心法测抗体（原 ）
待测抗体
* 酶标抗原
包被抗原
双抗原夹心法
Anti-HIV, Anti-HBs
* 酶标抗体
待测抗原
包被抗体
双抗体夹心法
） 19
ELISA的注意事项
• 标本：内源性（RF、补体、嗜异性抗体等） 外源性因素（溶血、细菌污染、保存不当、凝集不全、防腐剂NaN3等）（P229）
• 试剂：试剂质量、批号、是否失效（冰箱温度）、平衡（37度°C30分钟）、摇匀 • 加样：加样准确、不可太快，避免加在上部和产生气泡。 • 温育：温度（定期观察与登记）、时间、湿度、封片（不可重复用） • 洗板：洗涤液用蒸馏水或去离子水现配、防止洗板机堵塞、洗完要拍板。 • 显色：加试剂时不可重复加和漏加，或加在两孔之间，不要产生气泡，及时终止。 • 比色：建议用双波长（可排除标本浓度、干扰色、电路干扰、板底部划痕的影响）。 • 结果判定：反应终止后10分钟内 • 质量控制：内对照、室内质控、室间质评等（全程质控意识） • 表面抗原阳性结果、灰区标本、矛盾结果或少见模式均须复查 • 生物安全：试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。
ELISA）
酶联：抗原或抗体的酶标记。 免疫：以抗原抗体特异性反应为基础。 吸附：抗原或抗体包被于固相载体表面。
在固相载体表面实现抗原抗体的反应，通过酶标记的手段，酶催化底 物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的 抗原或抗体的量直接相关。
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ELISA技术特点
• 具有良好的灵敏度和特异性，能满足临床 需要，应用广泛。