测序常见问题及解决策略
一、PCR常见问题
1.假阴性，不出现扩增条带
PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：
1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。
2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。
3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩
增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性
假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。常见原因有：
1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短
或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组
或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法。
4.出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。
二、一代测序结果常见问题及分析
原始数据图片为：
图1
分析后无干扰峰的常规序列图为：
图2
常见问题有：
1.钉子峰
图3
产生原因：样品或毛细管内有气泡或灰尘、结晶等固体小颗粒反射激光，所以信号很高，而且所有波长（4色）都有。
解决办法：灌胶时不要产生气泡；使用过的毛细管在取下一段时间后，重新安装前要清洗；要经常擦去灰尘；样品纯化干净。
2.PCR产物测序时出现重叠峰
1）单一位点（图4）或两个位点（图5）的碱基缺失导致测序结果移码
图4
图5
产生原因：碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR 片段，如上图所示，单一位点或两个位点的缺失会导致测序结果移码，影响碱基的判读。
解决策略：①将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。或使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目的。②如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点，那么可以改变PCR反应条件，重新扩增。
2）测序引物碱基缺失
图6
产生原因：测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。
解决策略：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化。
3.克隆测序时出现峰形重叠
图7
产生原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是送测序的菌液污染。
解决策略：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。
4.样品有杂合/突变位点
图8
产生原因：范本中有杂合型突变，也就说范本本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。如果范本有杂合突变或缺失，那么测序图形中其他的位点一般都是单一的峰形，然后突然在某一个点出现重叠峰(如图中箭头所示)。
解决策略：建议将DNA片段克隆到载体再测序。
5.Poly A/T结构
图9
图10
产生原因：如图9、10所示，在Poly A/T结构出现后，测序酶容易在模板上滑动，导致Poly A/T结构后的峰形变得杂乱，出现移码现象。
解决策略：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。
6.G/C特殊结构区
图11
产生原因：序列中存在一个GC特殊结构区，在该区域后，信号迅速减弱。上图的下半部分是对测序反应进行优化后的测序结果，在GC特殊结构后，测序
信号得到一定程度的改善，但是离一般的测序结果还是相差甚远。
解决策略：针对该类型的模板，一般应从反向进行测序，然后在该特殊结构区附近将两个方向的测序结果拼接起来，得到完整的序列。
7.基因中含有重复序列
图12
产生原因：样品中含有重复序列导致的测序结果和Poly A/T的结果一样，会导致复制框滑动，较短的重复序列会导致测序结果出现移码；而较长的重复序列会使信号衰减。
解决策略：反向测序有时能够顺利的通过重复序列区域(但不是一定都能够)，通过多次的测序结果比对，拼接可以得到全序列结果。
8.背景峰杂
1）模板杂
