枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化

武汉工商学院

酶工程技术实训论文

学院：环境与生物工程学院

专业：生物工程年级：2014级

学生：学号: 指导教师：职称：

题目：枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化

2017年6月18日

目录

摘要 (1)

关键词 (1)

Abstract (1)

Keywords (1)

1 中性蛋白酶 (2)

1.1 中性蛋白酶的来源 (2)

1.2 中性蛋白酶的意义 (2)

1.3 枯草芽孢杆菌 (2)

1.4 枯草芽孢杆菌的产酶特征 (2)

1.5 枯草芽胞杆菌的形态特征 (3)

1.6 研究目的 (3)

2 实验材料与方法 (3)

2.1 仪器设备和耗材 (3)

2.1.1 仪器 (3)

2.1.2 耗材 (3)

2.2 枯草芽孢杆菌的筛选 (4)

2.3 粗酶液的制备 (4)

2.4 酶的分离纯化 (4)

2.4.1 硫酸铵饱和度的选择 (4)

2.4.2 蛋白酶活力测定 (5)

2.4.3 透析及层析 (5)

2.4.4 蛋白酶性质的测定 (5)

3 结果与分析 (6)

3.1 蛋白酶活力测定 (6)

3.2 透析除盐 (7)

3.3 柱层析分析 (7)

3.4 酶作用的最适 pH (8)

3.5 金属离子对酶活的影响 (9)

3.6 化学试剂对酶活的影响 (9)

4 结论与讨论 (10)

参考文献 (11)

枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化

摘要

中性蛋白酶作为一种生物催化剂已广泛用于食品、酿造、医药、纺织、制革等行业,本文对枯草芽孢杆菌的发酵产酶的提取质量条件进行了研究。利用硫酸铵分级盐析，葡聚糖层析纯化后蛋白酶总活力为38694U，蛋白酶比活力为4960.8U/mg。该酶的活力受到EDTA、异丙醇、乙醇抑制。钙离子、镁离子对该酶有较好的保护作用

关键词：枯草芽孢杆菌；中性蛋白酶；葡聚糖层析；分级盐析

Extraction quality analysis of producing neutral

protease from Bacillus subtilis

Abstract

Neutral protease as a biological catalyst has widely for food, and brewing, and medicine, and textile, and leather, industry, will enzyme technology application to seafood condiment, hydrolyzed of production in the, can formed enzyme method processing of unique advantages, makes fermentation products production cycle greatly shortened, and improve protein using, for, I on Bacillus subtilis spore Bacillus (Bacillus Substilis) of fermentation produced enzyme of extraction quality conditions for has research.

Keywords:Bacillus subtilis; neutral protease; Dextran chromatography;

fractionation; salting out

1中性蛋白酶

1.1中性蛋白酶的来源

蛋白酶是一类催化蛋白质肽键，生成蛋白胨、蛋白肽及氨基酸等产物的水解酶，其广泛分布于自然界的植物、动物和微生物中。例如木瓜蛋白酶主要来自于植物木瓜，胰蛋白酶来自动物的胰腺，来自微生物的蛋白酶没有特定名称，例如有来自AS1.398枯草芽孢杆菌的蛋白酶，有来自宇佐美曲霉的蛋白酶等等，其中微生物来源的蛋白酶数量与种类最多，也最具研究、开发与生产价值。随着水解条件之一的pH值的升高，蛋白酶分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，这也同时划分了它们应用的领域有所不同。

1.2中性蛋白酶的意义

中性蛋白酶是指最适作用pＨ介于6.0～7.5之间的一类蛋白酶，能催化蛋白质肽键水解。中性蛋白酶是最早被发现并广泛应用于生产的，由于其具有催化反应速度快，无工业污染，催化反应条件适应性宽等性质和优点，被广泛地应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业错误!未找到引用源。~[2]。生产中性蛋白酶可以从动植物组织中提取，以植物作为蛋白酶的来源会受到一些诸如气候条件、可利用土地面积的大小等因素的影响，而以动物作为蛋白酶的来源，其产量的大小主要依赖于可被屠宰牲畜的数量。由于从植物和动物中生产蛋白酶具有局限性，为了满足当今世界市场的需要，人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上。本试验所采用的产中性蛋白酶菌株为枯草芽孢杆菌错误!未找到引用源。。

1.3枯草芽孢杆菌

枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产a-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。

1.4枯草芽孢杆菌的产酶特征

利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明