免疫组化知识普及二抗免疫组化试剂盒共24页
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免疫组化一抗二抗原理一、免疫组化技术原理免疫组化技术是一种重要的生物化学检测方法,通过使用一抗和二抗的相互作用,来检测目标物质在细胞或组织中的分布和定量。
其原理主要包括以下几个步骤:1. 抗原表达和固定:首先,需要提取或制备出待检测物质的抗原,并将其固定在载玻片或微孔板上。
2. 样品处理:将待检测的细胞或组织样品处理,使其表达出目标物质。
3. 一抗处理:将经过特异性识别的一抗加入样品中,一抗能够与目标物质发生特异性结合,并形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗处理:加入与一抗来源物种不同的二抗,二抗能够与一抗发生特异性结合,并进一步增强抗原-抗体复合物的信号。
5. 检测信号放大:通过连接二抗的酶标记物或荧光标记物,可以进一步放大信号。
6. 显色或荧光检测:通过加入适当的显色剂或荧光探针,可以将特定信号转化为可见的颜色或荧光。
7. 显微镜观察:使用显微镜观察和分析样品中的标记信号分布情况,从而确定目标物质的位置和数量。
二、免疫组化技术应用免疫组化技术广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
具体应用包括:1. 细胞和组织定位:通过标记特定抗原或蛋白质,可以确定其在细胞或组织中的定位,帮助研究者了解其功能和相互作用。
2. 疾病诊断:免疫组化技术可以检测疾病标志物,如癌症标志物、病毒抗原等,用于早期诊断和病情监测。
3. 药物研发:免疫组化技术可用于评估药物在细胞或组织中的靶点表达和药效。
4. 免疫组织化学:通过标记细胞或组织中的特定分子,可以帮助鉴定组织类型、识别病理变化以及评估治疗效果。
5. 免疫组化芯片:免疫组化芯片技术结合了高通量技术和多路复用的优势,可以快速、准确地检测多个标志物,有望在个性化医疗中得到广泛应用。
三、免疫组化技术的发展前景随着生物技术和分子生物学的不断发展,免疫组化技术也在不断创新和改进。
未来的发展方向主要包括:1. 自动化和高通量:通过引入自动化设备和流程,提高实验的标准化和效率,同时实现多个标志物的高通量检测。
免疫组化免疫组化是组织化学的一种,它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点,通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂,如酶、金属离子、同位素等,显示一定的颜色,并借助显微镜观察其颜色的变化,从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。
免疫组化试剂盒:Vector Laboratories公司VECTASTAIN@ ABC免疫组化试剂盒:Vector公司于1977年率先开发出了生物素-亲和素系统,该产品系列是检测方法上的重要革命。
其后,公司发展出ABC技术(Avidin : Biotinylated Enzyme Complex Technology,亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术),并建立了著名的VECTASTAIN®ABC系统,目前,该系统被视为最灵敏、最可靠与最有效的染色系统,并被广泛应用于免疫组织化学、免疫电镜、原位杂交与凝集素化学中。
ABC技术利用生物素和卵白素具有极高亲和性的生物学特征,将卵白素和生物素化辣根酶按照一定的比例混合,形成ABC复合物。
该法亦被称作三步法,第一步为biotin化二抗和一抗结合,第二步为avidin(亲和素,A液)和二抗上的biotin结合,第三步为HRP偶联的biotin(B液)和avidin结合,而HRP再催化底物显色完成染色。
试剂盒组份:2ml试剂A(Avidin DH溶液)2ml试剂B(生物素化的酶)1ml生物素化的二抗(1.5mg anti-IgG/0.5mg anti-IgM抗体/2.1mg通用抗体)3ml阻断血清其中standard试剂盒只含有试剂A和试剂BVECTASTAIN®ABC系列产品VECTASTAIN®ABC-HRP Kits(辣根过氧化物酶)最通用的系统,使用范围广VECTASTAIN®ABC-AP Kits(碱性磷酸酶)灵敏度较高,染色密度较低,适于形态学染色非常重要的组织VECTASTAIN®ABC-GO Kits(葡萄糖氧化酶)灵敏度较低,适用于组织内源性HRP或AP 含量比较高的组织,常与HRP或AP系统配合进行双染。
免疫组织化学技术一,流程图:二,详细操作:(一)制作石蜡切片(详见后面的材料)(二)脱蜡,透明,水化1)脱蜡前先60度烘片30-40min;2)二甲苯脱蜡透明:将切片置于二甲苯中(3缸),各15min。
注意:若标本放入二甲苯后出现水雾或标本不呈现透明色,说明脱水没有脱干净,可重新放置二甲苯中;液体一定要没过标本3)梯度乙醇入水:将切片依次置入100%乙醇,95%乙醇,90%乙醇,80%乙醇,70%乙醇中,纯水(自己接),各5min;(三)抗原修复操作:1)6min45s烧开修复液(柠檬酸0.2g+柠檬酸三钠 1.5g蒸馏水稀释至500mL,PH为6.0)2)将组织放入修复液置于微波炉中焖5分钟3)将修复液1min20s再烧开4)组织再焖5分钟5)取出烧杯,使液体和组织自然冷却6)PBS冲洗3分钟1次,0.1%triton 10min(破坏细胞膜),PBS 冲洗3分钟1次(四)孵育操作:1)阻断内源性过氧化物酶:将切片置于3%过氧化氢10min,PBS冲洗3分钟x3次;2)封闭(非特异性染色阻断剂):每个脑片35ul山羊血清,室温下孵育30分钟(注意:此步操作后不用PBS冲洗);3)加一抗(PCNA兔抗大鼠):滴加适当比例稀释的一抗工作液(1:200比较好)2h,PBS冲洗3分钟⨯ 3次;加完一抗后,最好4度冰箱过夜,注意标本要保持湿度,可放在湿盒,第二天在37度或者室温复温30—40min,复温也要放在湿盒内4)加二抗(生物素标记的羊抗兔IgG复合物):室温孵育10分钟,PBS冲洗3分钟⨯ 3次;5)加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶:室温孵育10分钟,PBS冲洗3分钟⨯ 3次;(五)显色1)DAB染色:每个脑片35ul新鲜配制的DAB显色液,室温孵育10-20s(颜色有变就好,条件要自己摸)→大量自来水冲洗。
2)苏木素复染:苏木素染色30s(可以用塑料架子浸泡或者枪头滴)→自来水冲洗→PBS溶液返蓝10-20min(还可以浸泡10min的纯水)3)脱水,透明,封片:梯度乙醇脱水→二甲苯透明2-3分钟→中性树胶封片(现用电吹风吹干片,直接用中性树脂封片,晾干,观察片有脏时,可以用二甲苯擦洗背面)备注:1、PBS配制:团队常用一包PBS粉末,配制2000ml纯水,加6ml 的NAOH,PH在7.2-7.4,(不同的粉末,配制不一样,加入的NAOH 或者酸量不同,但是PH一般是一样的)2、一抗工作液,一般配制成5ml,0.3%的牛血清(0.15g),5%的羊血清(250ul),余加纯水3、一抗的浓度,不同的实验,浓度,物质都是不一样的4、DAB:缓冲液:底物:色源=20:1:1,每次配制都要有预留的部分,防止误差5、用枪:不要触及液体的地步,一档吸二档打完。
⼆步法抗兔、⿏通⽤型免疫组化检测试剂盒FOR RESEARCH USE ONLY.Code No:GK500705Storage: Store vial at 2-8.℃Intended UseChemMate? EnVision? Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, is intended for use inimmunocytochemistry together with the TechMate? and Autostainer Instruments. The kit is employed in atwo-step procedure where the first step is incubation of the tissue with an optimally diluted primary rabbit ormouse antibody, and the second step is incubation with the ChemMate? EnVision?/HRP , Rabbit/Mouse(ENV) reagent of the kit. This reagent is a peroxidase-conjugated polymer, which also carries antibodies torabbit and mouse immunoglobulins. The reaction is visualized by the ChemMate? DAB+ Chromogen alsoincluded in the kit.Reagents Materials providedBottle A ChemMate? DAKO EnVision?/HRP , Rabbit/Mouse (ENV)5 mL, ready-to-useDextran coupled with peroxidase molecules and goat secondary antibody molecules against rabbit andmouse immunoglobulins. In buffered solution containing stabilizing protein and preservative.Bottle B ChemMate? Substrate Buffer2*6.25 mLBuffered solution containing hydrogen peroxide and preservative.Bottle C ChemMate? DAB+ Chromogen1*0.25mL, 50 x concentrated3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride in organic solvent. The colour of this reagent may vary from strongviolet to colourless without having any influence on the performance of the kit.Precautions :1. Bottle A , ChemMate? EnVision?/HRP , Rabbit/Mouse (ENV), contains material of animal origin and it cannot be excluded that trace amounts of human material could be present due to manufacturing procedures. As with any product derived from biological sources, proper handling should be used.2. Do not expose Bottle C , ChemMate? DAB+ Chromogen or the Substrate Working Solution (CHROM) to strong light.3. Bottle C , ChemMate? DAB+ Chromogen contains 1.5% 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride, and is labelled: Harmful.Storage :Store the kit at 2-8 . The prepared Subs ℃trate Working Solution (CHROM) should be stored at 2-8 and used℃within 5 days.Quality Control : Each staining run should include a known positive control specimen to ascertain a proper performance of all the applied reagents. If the positive control specimen fails to demonstrate positive staining, labelling of test specimens should be considered invalid. A negative control reagent should be used with each specimen to identify any non-specific staining. If non-specific staining cannot be clearly differentiated from the specific staining, the labelling of the test specimen should be considered invalid.Please contact us for more information about this product.EnVision? Detection Kit,Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse⼆步法抗兔/⿏通⽤型免疫组化检测试剂盒剂型:⼯作液编号:GK500705适⽤:⼀抗为兔抗或⼩⿏抗的免疫组化检测储存:2-8℃该试剂盒是⼀个特别敏感的⼆步法免疫组化试剂盒,适合与兔抗抗体或⼩⿏抗抗体配⽤。
常用免疫组化试剂介绍概述免疫组化(IHC)是一门通过检测特定抗原在组织切片中的表达程度来揭示组织形态和细胞化学等方面信息的技术。
由于IHC是一种定性分析技术,所以该方法需要与定量技术(如分子生物学)结合使用,从而得到更准确的数据。
IHC涉及到多种试剂,其标记原理和表现形式各异,能够检测的抗原种类也不同。
本文将对常用的IHC试剂进行介绍,以此为指导,让大家更好地了解和应用IHC技术。
常用的免疫组化试剂抗原修复试剂抗原修复试剂(Antigen Retrieval)用于在组织样本中使细胞内蛋白与抗体亲和性和特异性增加。
这种试剂可通过热处理(如高压)或化学处理(如酶样蛋白和酸性处理)来复原被检测抗原的结构和功能。
常用的抗原修复试剂包括:EDTA、Tris、Citrate等。
原位杂交试剂原位杂交试剂(In Situ Hybridization)可检查DNA或RNA分子的特异性结合情况。
这种试剂可将RNA等分子与特定热稳定的蛋白质结合,用于检测基因突变等。
常用的原位杂交试剂包括:流式胶体金试剂、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、双链RNA原位杂交等。
细胞计数试剂细胞计数试剂(Cell Counting)用于获得细胞数量或结构变化。
这种试剂通常用于确定某一类细胞的数量、细胞计数和分离、细胞生长和分裂的应用。
常用的细胞计数试剂包括:皮质醇、14C-labeled thymidine等。
细胞信号转导试剂细胞信号转导试剂(Cell Signaling)用于研究细胞分子级别的通讯系统,并采取措施以确定物质在细胞内的作用机理。
常用的细胞信号转导试剂包括:抗体、试剂原和阻断类似物等。
同型抑制剂同型抑制剂(Isotype Control)用于在IHC实验中作为实验设计的对照组,以检测所观察的抗原与探测剂结合的特异性表现。
常用的同型抑制剂包括:IgG1、IgG2a和IgG2b等。
情况控制试剂情况控制试剂(Condition Control)用于确定IHC试验的最佳条件,包括温度、缓冲液、酸碱程度等。
(HopeBiot) 镇江厚普生物科技有限公司Zhenjiang Hope Biotechnology Co.,Ltd订货电话:*************传 真:*************网 站:http:// E-mail :*******************Histostain-Plus Kits免疫组化染色试剂盒货号:SP-9002简介: 本试剂盒为美国ZYMED 公司SP 系列试剂盒,全称为过氧化物酶标记的链霉卵白素(Streptavidin/Peroxidase )染色试剂盒。
由美国ZYMED 公司于1986年首建。
由于链霉卵白素的分子量是60kDa ,有四个亚基和生物素结合,等电点为6.5,所以该方法具有灵敏度高、特异性强、背景清晰、成本低廉的优点,是理想的免疫组化染色方法。
包装:试剂(无色液体): 3% H 2O 2去离子水, 6ml ;试剂A (蓝色液体):封闭用正常山羊血清工作液, 6ml ;试剂B (黄色液体):生物素化山羊抗小鼠IgG 二抗工作液, 6ml ;试剂C (橙色液体):辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP ),6ml 。
标本染色步骤:1, 石蜡切片,常规脱蜡至水。
2, 蒸馏水冲洗,PBS 浸泡5分。
(如需采用抗原修复,在此步骤后进行) 3, 3% H 2O 2去离子水(无色液体)孵育5-10分钟,以消除内源性过氧化物酶活性。
4, 滴加试剂A (蓝色液体)室温孵育10-15分钟,倾去,勿洗。
5, 滴加适当比例稀释的一抗,37℃孵育2-3小时或4℃过夜。
6, PBS 冲洗,3分钟×3次。
7, 滴加试剂B (黄色液体),室温或37℃孵育10-15分钟。
8, PBS 冲洗,3分钟×3次。
9, 滴加试剂C (橙色液体),室温或37℃孵育10-15分钟。
10,PBS 冲洗,3分钟×3次。
11,显色剂显色DAB 。
12,自来水充分冲洗。
E-mail:Website: 2-step plus Poly-HRP Anti Rabbit/Mouse IgG Detection SystemCat. No: E-IR-R211Size: 3 mL/ 6 mL/ 18 mL产品编号产品名称 3 mL 6 mL 18 mL Storage E-IR-R211A 3% H2O2 3 mL 6 mL 18 mL 2~8°CE-IR-R211B Polymer Helper (Ready-to-Use) 3 mL 6 mL 18 mL 2~8°CE-IR-R211C Polyperoxidase-anti-Mouse/Rabbit IgG (Ready-to-Use) 3 mL 6 mL 18 mL 2~8°C说明书一份产品简介Elabscience 公司最新推出的二步法免疫组化试剂盒,将二抗的单价Fab 片段和过氧化物酶HRP 聚合在一起,替代传统方法中的二抗和三抗,直接放大抗原抗体结合的信号,既保留了抗体特异性结合抗原的能力,又可有效地避免聚合分子过大而造成的空间位阻。
与传统的SP三步法相比,此试剂盒具有简单、快速、敏感等特点,试剂盒不再使用生物素,避免了由于内源性生物素所造成的背景染色。
本产品可用于检测一抗是Rabbit和Mouse来源的单克隆抗体或多克隆抗体,本品独特的聚合物辅助剂有利于大分子的检测系统更好地结合所检测的一抗分子。
此检测系统是目前已知的灵敏度最高的免疫组化检测系统。
使用说明1.脱蜡、水化组织切片。
2.根据所应用的抗原抗体要求,对组织切片进行抗原修复。
3.加E-IR-R211A 3% H2O2,孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶。
4.PBS或TBS 冲洗,3分钟×3次。
5.滴加适当稀释的一抗,室温或37°C孵育1~2小时或4°C过夜(后37°C复温30 min),PBS 或TBS冲洗,3分钟×3次。
小鼠TNF TNF--α免疫组化试剂盒免疫组化试剂盒该试剂盒以HRP 标记的链霉亲和素复合物(HRP Streptavidin Conjugate,HRP-SA)为基础,可用于检测细胞、组织内的特异性TNF-α抗原。
该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。
在所用的TNF-α一抗与相应靶抗原结合后,用生物化二抗与一抗特异性结合,最后加入HRP-SA,形成抗原—特异一抗—生物素化二抗—HRP-SA 复合物,显微镜下观察成像。
试剂盒所含试剂试剂盒所含试剂::试剂A 通透液:0.1% Triton-X 100 10 mL(选用)试剂B 封闭缓冲液(封闭用) 20 mL试剂C (原装进口分装)已稀释的即用型TNF-α一抗(2.5ml) 试剂D (原装进口分装)生物素化羊抗兔IgG 1支(浓度1.5 mg/mL,稀释比为1:300~1:500)50 μL+抗体稀释液20ml 试剂E HRP-SA 复合物1支(浓度1 μM,稀释比1:50~1:200)100 μL 试剂F DAB 显色液 5ml用户自备试剂用户自备试剂::1. 10mM TBS(pH7.2~7.4)三羟基氨基甲烷1.21g氯化钠7.6g加蒸馏水800mL,浓盐酸调pH 值至7.2~7.4,最后定容至1000mL TBS-T:TBS+Tween 20(0.05%体积比)2.抗原修复液(依检测抗原不同而选择不同的修复液)10mM pH6.0 柠檬酸缓冲液柠檬酸0.38g柠檬酸三钠2.45g加蒸馏水900mL,浓盐酸调pH 值至6.0,最后定容至1000mL或:0.5M EDTA 修复液(pH8.0)EDTA·2H2O 186.1g柠檬酸三钠2.45g加蒸馏水700mL,用10mM NaOH 调pH 值至8.0,最后定容至1000Ml3. 缓冲甘油封固剂10 mL4. Tween 20 5 mL石蜡包埋组织切片免疫染色石蜡包埋组织切片免疫染色实验步骤实验步骤((建议方案建议方案):):石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度1.烤片: 将待做切片置于切片架上,于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr;2.脱蜡: 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次10 min;3.水化: 切片经下行酒精水化,无水乙醇5min,95%乙醇2次(每次2min),85%乙醇2 min;75%乙醇2min,自来水冲洗,ddH2O 洗2×2min;4.抗原修复: 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复,常采用高压、微波(温度达到98~100℃)或酶消化修复法,室温自然冷却,自来水冲洗,ddH2O 洗2×2min,TBS 洗涤(2×2min)(具体修复方法见附1)* 注:有些抗原勿需修复,直接进入第5步封闭。
II 型胶原免疫组化试剂盒型胶原免疫组化试剂盒((IHC ) Collagen II IHC Assay说明书修订日期说明书修订日期::2015.07.13Cat number :KGA357 Store at 2-8℃ for 6 monthsFor Research Use Only (科研专用)一、试剂盒说明本试剂盒可用于免疫组织化学方法以显示人、大、小鼠来源的组织样本Collagen II 抗原分布。
本试剂盒适用于常规福尔马林固定石蜡包埋切片、冰冻切片、培养固定的细胞涂片等。
凯基即用型一步法免疫组化检测试剂盒与常规免疫组化染色试剂盒相比,具有高灵敏性、高特异性及操作简便的优点。
多个HRP 聚合物直接与二抗相连,大大放大了抗原抗体结合的信号,减少了孵育步骤,孵育时间缩短为10分钟。
试剂盒不含有生物素,完全避免了内源性生物素造成的背景影响。
试剂盒提供的DAB 显色试剂为增强型显色试剂,且自带稀释液,避免了由于水质的不同对DAB 显色造成的影响;与一般DAB 试剂相比,增强型的稳定性显著提高,显色更醒目,敏感性更高。
二、试剂盒组份组份Cat :KGA357 50 tests 备注 Collagen II 兔多抗 50 µl 2-8℃/-20℃ 增强剂3 ml HRP 聚合物 (即用型)3 ml 2-8℃试剂A :20×DAB 底物缓冲液A 160 µl 试剂B :20×DAB 底物缓冲液B 160 µl 试剂C :20×DAB 底物缓冲液C160 µl2-8℃,避光备注备注::抗体在2-8℃可以保存6个月个月,,长期保存可以分装保存于-20℃。
三、试剂盒以外自备试剂和仪器二甲苯、乙醇、蒸馏水或去离子水、3%H 2O 2-甲醇、10%山羊血清封闭液、10 mM PBS (pH 7.4)、免疫组化笔、苏木素染液、封片胶、显微镜四、使用注意事项1. 检测标本时需同时做阴性对照和阳性对照。
常用免疫组化试剂介绍完整版免疫组化试剂是一类用于检测细胞和组织中特定分子的试剂。
它们能够与目标分子发生特异性的结合反应,通过显色、荧光等方式实现目标分子的定位和检测。
常用的免疫组化试剂有抗体、底物、荧光染料等。
下面将详细介绍常用的免疫组化试剂。
一、抗体单克隆抗体:单克隆抗体是由单个克隆的B细胞分泌的抗体组成。
它们具有更高的特异性和一致性,适用于特定的免疫组化实验。
单克隆抗体一般通过酶联免疫吸附试验或杂交瘤技术获得。
二、底物底物是一种被特定酶催化后能够产生染色或荧光信号的化学物质。
在免疫组化实验中,常用的底物有DAB、VIP、AP、HRP等。
DAB:DAB(3,3'-二氨基联吡啶)是一种常用的免疫组化染色底物。
当DAB与过氧化物酶结合后,在特定条件下会产生棕色沉淀物,用于检测目标分子的位置。
VIP:VIP(维珍纳胶体阳离子)是一种特殊的底物,其在经过过氧化物酶催化后,形成带有阳离子电荷的胶体颗粒。
VIP用于染色后,可以形成黑色沉淀物。
AP:AP(碱性磷酸酶)是一种常用的底物,可以和特定基质反应生成可见或荧光信号。
AP基质有两种常用的类型,一种是快速红色溶液(Fast Red),另一种是紫色溶液。
HRP:HRP(过氧化物酶)是一种广泛使用的底物,在过氧化物酶的作用下可以产生明亮的荧光或染色信号。
HRP染色通常呈现为褐色或黑色。
三、荧光染料荧光染料是一种通过吸收特定波长的光线并在另一个波长下发射荧光的化合物。
免疫组化实验中常用的荧光染料有FITC、TRITC、Cy3、Cy5等。
FITC:FITC(荧光异硫氰酸酯或荧光同硫氰酸酯)是一种常用的绿色荧光染料,其在激发波长为488nm的波长下产生绿色荧光。
TRITC:TRITC(荧光异硫氰酸酯)是一种常用的红色荧光染料,其在激发波长为568nm的波长下产生红色荧光。
Cy3:Cy3是一种荧光发色团,其在激发波长为550nm的波长下产生黄绿色荧光。
Cy5:Cy5是一种荧光发色团,其在激发波长为650nm的波长下产生红色荧光。