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遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察阮燕晔;张莹;王波【摘要】以拟南芥atcwinvl 基因T-DNA插入纯合突变体和野生型植株为材料,比较研究了2种基因型植株在营养期和生殖期的形态差异.结果表明:拟南芥atcwinvl 基因T-DNA插入纯合突变体(简称突变体)较野生型萌发率平均下降5.88个百分点;突变体在44 d抽薹,较野生型延后4d;分支数平均4支,较野生型下降20.84%;果荚开裂时间6d左右,较野生型延长2d;单株果荚数平均62.27个,较野生型降低11.00%;单株果荚种粒数平均45.87粒,较野生型降低21.46%;突变体的单果荚长度平均14.52 cm,较野生型降低10.24%;单株果质量平均50.83mg,较野生型降低23.70%.拟南芥突变体在营养生长时期的株高平均10.44 cm,较野生型下降21.03%;主根长平均7.62 cm,较野生型下降14.96%;单株莲座叶面积平均3.16 cm2,较野生型下降13.90%;单株地上部分鲜质量平均81.81mg,较野生型下降11.11%;单株根鲜质量平均6.21mg,较野生型下降17.64%;单株地上部分干质量平均6.17 mg,较野生型下降15.60%;单株根干质量平均0.55mg,较野生型下降6.78%.拟南芥突变体在生殖生长时期的株高平均18.78 cm,较野生型增加4.22%;主根长平均16.48 cm,较野生型下降5.88%;单株莲座叶面积平均6.80 cm2,较野生型下降6.21%;单株地上部分鲜质量平均129.85 mg,较野生型下降9.69%;单株根鲜质量平均9.97 mg,较野生型下降13.23%;单株地上部分干质量平均9.22 mg,较野生型下降4.16%;单株根干质量平均0.70mg,较野生型下降6.67%.以上研究结果表明,atcwinvl 基因T-DNA插入突变影响了拟南芥植株正常的生长发育.%In the research, homozygous mutant (atcwinvl) and wild type of Arabidopsis were used to compare plant morphological differences in the period ofvegetative growth and reproductive growth. The results showed that compared to the wild type the germination rate of atcwinvl averagely decreased by 5.88 percentage points; compared to the wild type, bolting time of atcwinvl was 44 d, delayed 4 days;branch number of atcwinvl was 4, decreased by 20. 84 ％ ;cracking time of the pod of atcwinvl was 6,delayed 2 days;fruit pod number per plant of atcwinvl was 62.27,decreased by11.00％ ,fruit number of a pod of atcwinvl was 45.87,decreased by21.46％;length of a fruit pod of atcwinvl was 14.52cm,decreased by 10. 24％fruit weight of a plant of atcwinvl was 50. 83mg,decreased by 23.70％. In the period of vegetative growth,compared to the wild type, plant height of atcwinvl was 10.44cm, decreased by 21. 03％; root length of atcwinvl was 7.62cm, average decreased by 14. 96％; area of rosette leaf of atcwinvl was 3. 16 cm2 ,decreased by 13.90％ ;aboveground fresh weight of per plant was 81.81 mg, decreased by 11.11％ ;fresh weight of root per plant was6.21mg, decreased by 17.64％ ;aboveground dry weight of per plant was 6.17 mg, decreased by 15.60 ％ ;dry weight of root per plant was 0. 55mg,decreased by 6. 78 ％ ;In the period of reproductive growth, compared to the wild type, plant height of atcwinvl was 18. 78cm,increased by4.22％ ;root length of atcwinvl was 16.48cm,averagely decreased by5.88％; area of rosette leaf of atcwinvl was6.80 cm2, decreased by 6.21％; fresh weight of a plant of atcwinvl was 129.85 mg,decreased by 9.69％ ;fresh weight of root per plant was 9. 97 mg,decreased by 13.23％ ;aboveground dry weight of per plant was 9.22 mg, decreased by 4. 16％ ;dry weight of root per plant was 0. 70mg,decreased by 6.67％. The results obtainedshowed that growth of Arabidopsis was influenced by T-DNA insertional mutagenesis of atcwinvl gene.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2011(040)005【总页数】5页(P62-66)【关键词】拟南芥;atcwinvl基因;T-DNA插入突变;基因功能【作者】阮燕晔;张莹;王波【作者单位】沈阳农业大学,生物科学技术学院,辽宁沈阳110866;沈阳农业大学,生物科学技术学院,辽宁沈阳110866;沈阳农业大学,生物科学技术学院,辽宁沈阳110866【正文语种】中文【中图分类】Q789蔗糖是高等植物体内光合产物运输与分配的主要形式,其在植株中定向运输和分配的方式不仅调控植株的整个生长和发育进程,也决定作物的产量和品质。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
拟南芥AtSuc3和AtSuc4基因的克隆及双价植物表达载体的构建张彦伟;祝建波;沈海涛;王爱英;向本春【摘要】蔗糖转运蛋白在调节同化产物的分配过程中起重要作用.为了分析拟南芥蔗糖转运蛋白基因AtSuc3、AtSuc4的功能和协同作用,以哥伦比亚型拟南芥为材料,通过RT-PCR技术克隆了蔗糖转运蛋白基因(sucrose/H+ cotransporters,SUCs)AtSuc3和 AtSuc4的cDNA,利用甘薯贮藏蛋白基因(sporamin)的根部特异性启动子,构建了含有含有AtSuc3和 AtSuc4 cDNA的单价植物表达载体pBI2301-q3-s3、pBI2301-q4-s4和双价植物表达载体pBI2301-q3-s3-q4-s4,为进一步分析该植物表达载体在调控库源关系中的作用以及在经济作物中的应用奠定基础.【期刊名称】《石河子大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(028)001【总页数】5页(P6-10)【关键词】蔗糖转运蛋白;AtSuc3;AtSuc4;植物表达载体;构建【作者】张彦伟;祝建波;沈海涛;王爱英;向本春【作者单位】石河子大学生命科学学院/石河子大学农业生物技术重点实验室,石河子,832003;石河子大学生命科学学院/石河子大学农业生物技术重点实验室,石河子,832003;石河子大学生命科学学院/石河子大学农业生物技术重点实验室,石河子,832003;石河子大学生命科学学院/石河子大学农业生物技术重点实验室,石河子,832003;石河子大学生命科学学院/石河子大学农业生物技术重点实验室,石河子,832003【正文语种】中文【中图分类】Q782;S945.19蔗糖是植物光合作用同化产物最主要的转运形式,其转运的方向和速率对于高等植物的生长发育至关重要[1]。
蔗糖由源向库的运输是通过韧皮部进行的。
光合同化物进出韧皮部筛管分子是以两种不同模式转运的,即共质体途径和质外体途径[2]。
拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定【摘要】拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一。
实验将获得T-DNA插入某基因造成的突变种，插入基因功能进行判断。
筛选出纯种突变型，同时进行PCR法序列鉴定纯种突变型、杂种突变型与野生型。
1.引言：反向遗传学：经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入\缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。
与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。
实验材料拟南芥：拟南芥又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：①植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；②生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；③种子多，每株每代可产生数千粒种子；④形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；⑤基因组小，只有5对染色体；⑥拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。
拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。
这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。
突变体获得：插入诱变（insertional mutagenesis），即将外源DNA随机插入到拟南芥基因组中，获得突变体。
当外源DNA“击中”某一基因时，这个特定基因就被关闭。
常用的插入诱变方法为农杆菌转化法。
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
拟南芥突变体的鉴定摘要在真核细胞的细胞核中，基因组DNA缠绕在组蛋白上，形成核小体的结构。
核心组蛋白的末端会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP－核糖基化等。
这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用。
组蛋白的甲基化发生在赖氨酸和精氨酸位点，这些位点的甲基化参与异染色质形成，X染色体失活和基因转录的激活与沉默等许多重要的生物学功能。
早先认为组蛋白上的甲基化是不可逆的。
然而近年来在哺乳动物和酵母中相继发现了许多组蛋白去甲基化酶。
其中最大的一个基因家族是包含有JMJC结构域的组蛋白去甲基化酶家族。
在植物中还没有报道有组蛋白去甲基化酶。
我们通过基因组注释以及序列比对从拟南芥中鉴定出21个编码包含有JMJC结构域蛋白的基因。
并从SALK突变体库中筛选鉴定了相应的T-DNA插入突变体。
利用分子标记，我们筛选出了37个纯合T-DNA插入株系。
给我们以后分析这些基因在植物生长发育中所起的作用打下了坚实的基础。
关键词组蛋白密码, 甲基化，去甲基化，T-DNA插入突变体1 背景介绍1.1 “组蛋白密码”理论与表观遗传学在真核细胞的细胞核中，基因组DNA与组蛋白和非组蛋白相互结合，构成遗传信息的物质载体——染色质。
染色质由其基本单位核小体重复连接而成，每个核小体包含一个组蛋白八聚体（H2A/H2B-H3/H4-H3/H4-H2A/H2B）和围绕其上的两圈超螺旋DNA（146KB），核小体之间通过不同长度的超螺旋DNA和H1组蛋白前后相接。
组蛋白八聚体的成员作为核小体的基本组成元件，在所有真核生物中高度保守。
尽管核心组蛋白均具有一个三螺旋的结构严整的组蛋白折叠区，其两个末端却没有形成固定结构。
然而，这些末端却会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP－核糖基化等。
这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用（1，2）。
T-DNA插⼊鉴定实验报告T-DNA插⼊突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有⼀段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能⾃发转移进植物细胞，并插⼊植物染⾊体DNA中。
所以Ti质粒上的这⼀段能转移的DNA被叫做T-DNA。
将感兴趣的基因改造插⼊到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。
通过本实验，我们将学习如何⽤PCR的⽅法检测所得植株是否为T-DNA的插⼊突变体。
1.引⾔T-DNA作为⼀种实验常⽤的遗传转化⽅法，在插⼊突变过程中，插⼊到植物染⾊体上的位置是随机的。
如果T-DNA插⼊进某个功能基因的内部，特别是插⼊到外显⼦区，将造成基因功能的丧失。
所以利⽤农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的⼀种重要⽅法。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA 插⼊的纯合突变体，杂合突变体，和野⽣型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
本次实验中，采⽤液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采⽤琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不⼀的DNA带，以确定样品是否为T-DNA插⼊突变纯和体。
PCR（Polymerase ChainReaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率⾼、快速、简便、重复性好、易⾃动化等突出优点；能在⼀个试管内将所要研究的⽬的基因或某⼀DNA⽚段于数⼩时内扩增⾄⼗万乃⾄百万倍,使⾁眼能直接观察和判断。
（PCR基本原理如右图）DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。
⾃由电泳时，由于不同⼤⼩的DNA⽚段的电荷密度⼤致相同，各核酸分⼦难以分开；选⽤适当浓度的琼脂糖凝胶作为⽀持物，使之具备⼀定的孔径，即可发挥分⼦筛效应，使⼤⼩不同的核酸⽚段迁移率出现较⼤差异，达到分离的⽬的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作⽤。
拟南芥At2g23470基因T-DNA插入突变体的鉴定李斯琪;宋欣;赵淑清【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2017(045)005【摘要】At2g23470是拟南芥功能未知结构域DUF647蛋白家族的一个成员.为了研究At2g23470基因的功能,需要获得At2g23470功能缺失的突变体材料.根据拟南芥信息资源网站(The Arabidopsis Information Resource,TAIR)上公布的At2g23470基因可利用的T-DNA标签品系,从美国拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center,ABRC)购买了2套独立的At2g23470基因的T-DNA插入GABI-Kat株系种子,运用PCR法对这些T-DNA插入突变体进行了基因型分析和鉴定,结果获得了3个纯合的T-DNA插入位于RUS4启动子上的株系和1个T-DNA插入位于第2外显子的株系.RT-PCR分析表明,T-DNA插入位于第2外显子的株系中,At2g23470基因的表达完全缺失.该突变材料的获得为深入研究At2g23470基因的功能奠定了良好的基础.%At2g23470 is a member of the Domain of Unknown Function 647 protein family that is conserved in diverse eukaryotic organisms.To identify Arabidopsis T-DNA insertion mutants at the At2g23470 locus,we screened the ABRC collections.Two independent T-DNA lines carrying a T-DNA insertion either at the promoter or in the second exon,respectively,were genotyped using PCR-based analysis of genomic DNA.RT-PCR of homozygous T-DNA insertion mutants,using At2g23470-specifc primers,exhibited increasedAt2g23470 transcript levels in homozygous mutants with insertion at thepromoter;whilst At2g23470 transcripts could not be detected in the homozygous mutant with T-DNA insertion at the exon,indicating that it contains a null mutation in the At2g23470 gene.These homozygous mutants have laid a foundation for investigating the function of At2g23470 gene in Arabidopsis growth and development.【总页数】5页(P684-688)【作者】李斯琪;宋欣;赵淑清【作者单位】山西大学生物技术研究所,山西太原030006;山西大学生物技术研究所,山西太原030006;山西大学生物技术研究所,山西太原030006【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.拟南芥核苷磷酸化酶基因的组织表达及其T-DNA 插入突变体鉴定 [J], 徐文晶;程玉祥2.拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察 [J], 阮燕晔;张莹;王波3.拟南芥花粉表面蛋白基因T-DNA插入突变体的鉴定 [J], 易素华;张丞;史志浩;杨仲南;张森4.拟南芥β-罗勒烯合成酶基因T-DNA插入突变体的鉴定 [J], 马泉芳;魏然;刘春林5.拟南芥At5g58100基因T-DNA纯合插入突变体PCR鉴定及表型观察 [J], 刘瑶; 刘春宏; 庞朝廷; 高菊芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
拟南芥AtSUC突变体在干旱胁迫下的形态学差异
韩雪;刘广文;樊金娟
【期刊名称】《辽宁农业科学》
【年(卷),期】2010(000)003
【摘要】研究以拟南芥野生型和蔗糖转运蛋白单基因纯合突变体atsuc3、atsuc5、atsuc9为材料,利用不同浓度的聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫,研究了对其生
长发育的影响.试验结果表明:PEG模拟干旱胁迫使野生型和AtSUC突变体抽苔时间、开花时间、果荚个数和种子千粒重,以及水势和相对含水量均发生变化,而且不
同突变体之间变化趋势有显著差异,说明该家族中不同成员对在干旱胁迫下的作用
不同.
【总页数】5页(P26-30)
【作者】韩雪;刘广文;樊金娟
【作者单位】沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学生
物科学技术学院,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁,沈
阳,110161
【正文语种】中文
【中图分类】Q945.78
【相关文献】
1.拟南芥Atsuc2突变体愈伤组织的诱导及再生体系的建立 [J], 崔震海;李晓宇;张立军;汪澈;阮燕晔;樊金娟
2.拟南芥一氧化氮相关突变体在干旱胁迫下抗旱相关基因表达的研究磁 [J], 刘建中;张双双;许为
3.逆境下拟南芥野生型和突变体sex1游离态水杨酸含量及根形态差异 [J], 赵培臣;贺殿
4.拟南芥T-DNA插入突变体ATSUC3的PCR鉴定 [J], 李敏;杨双;阮燕晔;樊金娟;张立军
5.拟南芥乙烯突变体在干旱胁迫下的形态学差异 [J], 段喜华;孙莲慧;郭晓瑞;王化楠;祖元刚
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拟南芥的全基因组插入突变体分析
AlonsoJM StepanovaAN LeisseTJ 常立
【期刊名称】《植物学通报》
【年(卷),期】2003(20)6
【总页数】1页(P766-766)
【关键词】拟南芥;全基因组;插入突变;基因功能
【作者】AlonsoJM StepanovaAN LeisseTJ 常立
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】Q943
【相关文献】
1.拟南芥SYTA基因T-DNA插入纯合突变体的鉴定及表型分析 [J], 谢林峰;罗勤;张亚;赵哲;杨毅
2.利用TAIL-PCR技术分析拟南芥At1g52910突变体插入位点的侧翼序列 [J], 田蕾;郭妍君;任丽;王钰;孙菲;齐海坤;马楠;戚晓利
3.全基因组分析玉米MuDR转座因子插入突变体库 [J], 冯静;傅学乾;王婷婷;陶勇生;高友军;郑用琏
4.拟南芥全基因组精细插入及缺失分子标记 [J], 施亚磊;于静芳;吴珂;周俊
5.利用全基因组重测序技术鉴定五指山猪GHR突变体转基因插入位点 [J], 魏强;李勇;奥岩;杨漫漫;陈涛;韩虎;张兴举;王然;夏秋菊;姜芳芳
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