尾加压素II在2型糖尿病小鼠骨骼肌组织
中的表达情况
作者:张思凡
单位:北京市陈经纶中学
辅导老师: 黄臣田超
指导专家:王学江
目录
摘要 (2)
前言 (3)
实验目的 (3)
材料与方法 (4)
实验结果 ........................................... 错误！未定义书签。
讨论 . (9)
结论 (11)
参考文献 ........................................... 错误！未定义书签。
附录 ............................................... 错误！未定义书签。
致谢 ............................................... 错误！未定义书签。
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摘要
目的探讨T2DM时小鼠骨骼肌组织UII/UT系统的表达变化情况。
方法采用免疫组化、RT-PCR实验观察骨骼肌组织中UII/UT系统的表达；采用血糖测定仪检测2型糖尿病的特征。
结果 1. 在遗传性2型糖尿病小鼠模型上，证实2型糖尿病小鼠骨骼肌组织中UII/UT系统高表达。
用放免法测定到2型糖尿病小鼠血浆UII含量明显高于对照小鼠；骨骼肌组织UII含量和释放到孵育液中的UII含量分别较对照动物高；免疫组化染色发现T2DM小鼠骨骼肌组织中UII的含量较对照组增高。
结论 1. 2型糖尿病小鼠骨骼肌UII/UT系统上调。
2. UII抑制胰岛素刺激的骨骼肌的糖摄入，提示骨骼肌UII可能以旁/自分泌方式作用于骨骼肌参与了胰岛素抵抗的发病
关键词尾加压素II；2型糖尿病；胰岛素抵抗
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前言
胰岛素抵抗指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。
胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要表现之一，主要是肝脏、肌肉和脂肪组织对胰岛素的敏感性和反应性降低。
胰岛素抵抗发病机制目前并不完全清楚，不仅与遗传因素高度相关，而且与胰岛素信号传导缺陷、多种脂肪源性细胞因子表达异常、物质代谢异常、炎症介质和氧化应激等诸多因素有关。
越来越多的研究提示血管活性因子、尤其是缩血管因子的调节紊乱参与胰岛素抵抗及糖尿病的发病，如血管紧张素II、内皮素等。
尾加压素II也是体内重要的血管活性肽，具有与内皮素相似或更强的收缩血管和促进血管平滑肌细胞增殖效应。
尾加压素II最早是从鱼的脊髓尾部下垂体中分离出的生长抑素样环肽，后证实从软体动物到哺乳动物的神经系统均存在UII，并且目前已经从人体中克隆出来。
UII的特异性受体是人体内一种孤立的G蛋白耦联受体，又称为UT。
UII与UT结合后引起一系列生物学效应，参与多种疾病的发生。
例如，在中枢神经系统中，可以引起交感神经兴奋，释放肾上腺素和促肾上腺皮质激素，对心率、呼吸和血压也具有一定的调节作用。
在心血管系统，UII可以引起冠状动脉收缩和反射性心动过速。
在外周血管中，UII是迄今为止发现的最强的缩血管物质，可引起内皮炎症，导致内皮损伤。
在肾脏，UII可以减少肾脏血流，使上皮细胞增殖。
近来研究发现，UII对胰腺也具有一定的作用，可以减少胰岛素的分泌。
由于UII是迄今为止发现的最强的缩血管物质，因此人们对它的研究最初主要集中在心血管方面。
在心血管系统中，UII参与了心力衰竭和心肌肥大，冠心病和冠状动脉粥样硬化，肾功能衰竭等这些疾病。
近年大量实验资料显示UII还参与糖代谢的调节、在糖尿病及其并发症的发病中具有重要作用，尤其是2型糖尿病。
2型糖尿病占糖尿病总数的90%以上，它的发生主要与胰岛素抵抗有关。
目前有大量数据表明炎症因子是骨骼肌胰岛素抵抗的一个病因，而它与骨骼肌中UII/UT系统有何关系并不清楚。
本工作旨在观察T2DM时骨骼肌组织中UII/UT系统内源性表达的变化及其意义，及影响这种表达的因素。
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实验材料与方法
一、实验动物与细胞系
KK小鼠是日本学者培育的一种轻度肥胖型T2DM动物，KK小鼠有明显的多食，从5周龄起，血糖、血胰岛素水平逐步升高，1岁龄时，多食、高血糖、高胰岛素血症、肥胖及肝脏对胰岛素的敏感性可自发恢复正常，但其生命明显缩短。
对照组小鼠（C57BL/6J）体重20-30g，12周龄。
所有小鼠实验当日清晨空腹自尾静脉采血测定其空腹血糖，随后自由饮食，1-2小时后测其随机血糖。
分离双下肢的比目鱼肌，用中性福尔马林固定用于免疫组化。
肌原细胞C2C12细胞株购自中国医学科学院基础研究所。
二、主要试剂和仪器（表1、表2）
表1 主要试剂
Table 1 Main regents
试剂生产厂家
DMEM高糖培养基美国Hyclone公司
特级胎牛血清美国Gibco公司
青霉素-链霉素溶液美国Gibco公司
胰蛋白酶(trypsin) 美国Gibco公司
二甲基亚砜(DMSO) 美国Sigma公司
UII放免试剂盒UII多克隆一抗UII多肽Honenix Pharmaceuticals Honenix Pharmaceuticals Honenix Pharmaceuticals
山羊抗兔IgG 北京中杉金桥生物技术有限公司DAB染色试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司
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表2 主要仪器
Table 2 Main instruments
仪器
生产厂家 电子天平
德国Sartorius 公司 超速低温离心机
美国Sigma 公司 紫外可见分光光度计
Unico 公司 二氧化碳培养箱
美国Revco 公司 PB-600 型恒温水浴箱
BOEKELScientific 倒置显微镜
日本Olympus 公司 石蜡切片机
北京东方仪器厂 制冰机
日本三洋公司 pH 计
德国Sartorius 公司 超纯水制备装置
美国Millipore 公司 微量移液器
德国Eppendorf 公司 超净工作台
硝酸纤维素膜 天津泰斯特公司 Waters 公司
二、实验方法
1．C2C12细胞的培养及传代
该细胞系用含15%胎牛血清，青霉素100 U/ml ，链霉素100 U/ml 的高糖
DMEM
培养基在37℃，5% CO2条件下培养。
（1）细胞复苏
①紫外照射超净台30min，擦
②于-80℃低温冰箱中取卵圆
细胞一支，37℃水浴中迅速融化，
加至8ml完全培养基中，1200r
离心8min。
③弃上清，沉淀用3ml完全培
养基重悬，接种至细胞培养
瓶中，放入孵箱培养。
（2）细胞传代
①紫外照射超净台30min，擦拭超净台台面。
②弃原培养基，PBS洗两次。
③加入胰酶消化至细胞变圆，细胞间隙变宽，弃胰酶，加入3ml培养基终止消化。
④吹打细胞使细胞呈悬浮状态，分瓶，补足培养基，放入孵箱培养。
（3）细胞冻存
①紫外照射超净台30min，擦拭超净台台面。
②弃原培养基，PBS洗两次。
③加入胰酶消化至细胞变圆，细胞间隙变宽，弃胰酶，加入3ml培养基终止消化。
④1200r离心8min，弃上清，沉淀用冻存液重悬（冻存液配制：血清：DMSO=9:1）。
⑤度降温：4℃放置1h，-20℃放置30min，-40℃放置30min，放入-80℃低温
冰箱保存。
（4）细胞计数
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将稀释后的细胞悬液滴于计数板上，使悬液自由充满盖片下方间隙，勿留气泡，稍候片刻，镜下观察并计算出四角大格内的细胞数。
压线者只计上线和右线的细胞，然后按下式计算出细胞浓度：（4大格中的细胞数/4）*10000*稀释倍数=细胞数/ml。
2. 免疫组织化学染色
1）切片常规脱蜡至水
2）缓冲液洗3min/2次
3) 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性北京染色，将切片放在3%过氧化氢中孵育30分钟
5）抗原修复：15min
95℃，室温45-60min
6）滴加一抗工作液 4℃孵
育过夜
7）缓冲液洗5min/2次
8）滴加酶标二抗，在室温
下孵育30min
9）缓冲液洗5min/2次
10）向1mlDABPlus Substrate中滴加1-2滴DAB Plus Chromogen，混匀后滴加到切片上，孵育3-15min
11）自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
研究过程
1 检测T2DM组和对照组小鼠血糖、血浆中胰岛素含量
8只KK小鼠和8只C57BL小鼠。
实验前禁食2-4h，自由饮水。
使用罗氏血
糖测定仪自尾部采血测定小鼠空腹血糖及随机血糖含量。
采用放免法测定血浆中
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胰岛素含量。
2检测小鼠骨骼肌组织中UII的表达
取两组小鼠骨骼肌组织做石蜡切片进行免疫组织化学染色检测两组小鼠骨骼肌组织中UII蛋白的表达及其组织细胞定位
3分离双下肢的比目鱼肌，取10mg左右的组织。
37°C孵育4h，孵育结束后，取孵育液放免方法测定其UII含量。
实验结果
1kk小鼠呈典型T2DM表现
kk小鼠为轻度肥胖型T2DM动物，具有多食、高血糖、高胰岛素血症、肥胖特征。
我们的实验结果显示：与对照组比较，kk小鼠组成的T2DM组动物更肥胖，体重重93.6%；空腹血糖高91.3%；血浆胰岛素含量高86.6%。
表明kk小鼠呈典型T2DM表现，与文献报道一致，见表1。
Control T2DM
Body weight（g）20.2±1.6 39.1±2.4*
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Casual blood glucose(mmol/L) 9.5±2.4 23.0±1.9*
Fasting blood glucose(mmol/L) 4.6±1.1 8.8±0.5*
Plasma insulin(pmol/mL) 299.3±39.4 558.5±71.0*
2免疫组化结果显示对照组小鼠骨骼肌细胞有棕黄色的颗粒，主要分布于胞浆中；而T2DM组可见到较强的UII蛋白的表达，提示T2DM时骨骼肌组织中UII/UT系统高表达。
3T2DM小鼠骨骼肌分泌释放UII增加
以往的文献已报道T2DM时，动物及人血浆中UII含量升高，但其升高的来源并不清楚，有文献报道血管内皮细胞时血浆中UII的一个来源。
骨骼肌占体重的70%，而且骨骼肌组织作为一个内分泌器官受到了越来越多的重视，那么骨骼肌是否能够产生和释放UII，且T2DM时骨骼肌产生和释放的UII是否是血浆中UII升高的一个来源并不清楚。
我们的结果发现，与对照组相比较，T2DM组血浆中UII含量高51.4%，与文献报道相一致；骨骼肌组织UII含量高21.8%，但差异无统计学意义，表明骨骼肌组织能够产生UII。
Control mice T2DM mice Plasma UII content(pg/mL) 137.5±31.4 208.1±28.7*
Skeletal muscle(pg/mg protein) 3.3±0.3 4.0±0.5*
Cell incubation liquid(pg/mg
36.0±8.4 51.8±4.2*
protein)
*P<0.05 vs. control group
讨论
本工作采用遗传性T2DM小鼠为观察对象，发现由KK小鼠组成的T2DM组呈现肥胖、空腹高血糖、随机血糖及血浆中胰岛素的含量均明显高于有C57BL 小鼠组成的对照组，呈典型T2DM表现，与文献报道一致。
用放免方法测定到T2DM小鼠血浆UII含量明显高于对照C57BL小鼠，骨骼肌组织UII含量和释放到孵育液中的UII含量分别较对照动物高21.8%和44.1%，说明骨骼肌组织能够
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产生UII，而且能够分泌UII。
免疫组化显示对照组小鼠骨骼肌也富含UII，而T2DM 小鼠骨骼肌组织中UII的表达较对照组明显增多，这从形态学的角度进一步证明了T2DM时骨骼肌中UII含量明显增加。
胰岛素抵抗指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。
胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要表现之一，主要是肝脏、肌肉和脂肪组织对胰岛素的敏感性和反应性降低。
IR发病机制目前并不完全清楚，不仅与遗传因素高度相关，而且与胰岛素信号传导缺陷、多种脂肪源性细胞因子表达异常、物质代谢异常、炎症介质和氧化应激等诸多因素有关。
越来越多的研究提示血管活性因子、尤其是缩血管因子的调节紊乱参与胰岛素抵抗及糖尿病的发病，如血管紧张素II、内皮素和儿茶酚胺等。
血管紧张素II主要通过干扰胰岛素信号传递、抑制脂肪细胞分化、降低胰岛素靶组织对胰岛素的敏感性、诱导抑制胰岛素作用的细胞因子生成等多方面的作用，在胰岛素抵抗的发生和发展中起着重要作用。
UII也是体内重要的血管活性多肽，具有与内皮素相似或更强的收缩血管和促进血管平滑肌增殖效应。
我们的研究表明UII参与了骨骼肌葡萄糖的摄取。
近年大量实验研究资料发现骨骼肌也是一种重要的内分泌器官，能表达、合成和分泌多种生物信号分子，以内分泌、旁分泌和自分泌方式参与代谢调节和某些疾病的发病过程。
我们的结果表明骨骼肌中UII/UT系统参与了胰岛素抵抗的发生。
Kazuhito等人报道了T2DM患者血浆UII水平明显升高，为了了解血浆中UII升高的来源，他们培养了人冠状动脉内皮细胞和脐静脉内皮细胞，结果发现这两类血管内皮细胞上都表达UIImRNA，考虑到血管床占人体相当大的一部分，推测内皮细胞可能是血浆中UII的重要来源。
但是，他们又发现在血管内皮细胞UIImRNA的表达水平明显不如脊髓高，与人的心脏、肝脏和肾脏相当。
因此不能排除血中UII其他来源的存在。
鉴于目前越来越多的资料显示骨骼肌合成和分泌许多生物活性物质，认为骨骼肌也是人体重要的内分泌器官。
按其重量计算，骨骼肌约占人体体重的40%，可被视为人体最大的分泌器官。
本实验证实骨骼肌
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合成和分泌UII，推测骨骼肌源UII可能是机体及血循环中UII的重要来源之一。
UII刺激骨骼肌胰岛素抵抗发生的机制尚不清楚，值得进一步探讨。
创新点
本工作首次报道2型糖尿病小鼠骨骼肌UII/UT系统上调；UII抑制胰岛素刺激的骨骼肌的糖摄入，提示骨骼肌来源的UII可能以旁/自分泌方式作用于骨骼肌参与了胰岛素抵抗的发病。
参考文献
∙[1] 李京艳,唐洁,王敬,周毓玲,冀秋娣. 对氧磷酶-1与2型糖尿病的关系研究[J]. 天津医科大学学报.
2007(04)
∙[2] 应俊,肖伟,潘若望,曹小恩,李佩珍,张洪勤. 瘦素受体基因Pro1019 Pro变异与浙南地区2型糖尿病的相关性研究[J]. 中国微循环. 2009(05)
∙[3] 应俊,石楠松,潘若望,李佩珍,张洪勤. 瘦素受体基因Gln223Arg变异与浙南地区2型糖尿病的相关性研究[J]. 中国老年学杂志. 2009(07)
∙[4] 杨光燃,杨金奎. 2型糖尿病视网膜病变易感基因研究进展[J]. 医学综述. 2011(20)
∙[5] 闻杰,陆志强,李晓牧,吴丹,张忆文,滕香宇,谭燕,殳雪怡,杨永年. 亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性及同型半胱氨酸与2型糖尿病微量白蛋白尿的相关性[J]. 上海医学. 2008(01) ∙[6] 陈静,潘琳,赵学锋,柴莉,魏颖丽,霍正浩. 肿瘤坏死因子α基因启动子区-308位点多态性与2型糖尿病的相关性研究[J]. 宁夏医学杂志. 2009(05)
∙[7] 钟严伟,高玲,吴少庭,耿艺介,余英祥. PC-1基因K121Q多态性与2型糖尿病相关性研究[J]. 中国热带医学. 2006(12)
∙[8] 李慧华,杨敏,余敏,周宏灏,刘昭前. β3-AR Trp64Arg遗传多态性对T2DM患者罗格列酮疗效的影响[J]. 中国药理学通报. 2009(03)
∙[9] 陈萍,潘艳慧,孙冬琳,白静,傅松滨. 亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与2型糖尿病的关系[J]. 齐齐哈尔医学院学报. 2008(06)
∙[10] 王群,马增霞,邱书娟. 血管紧张素转换酶基因多态性与2型糖尿病肾病的相关性[J]. 山东医药.
2007(26)
11。
