全面酶联免疫吸附实验.ppt

二、双抗体夹心法 此法常用于测抗原。将已知抗体吸附
于固相载体，加入待检标本（含相应抗原） 与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗体和 底物显色进行测定（图2）。
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图2: 双抗体夹心法测抗原示意图
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第二部分: 常用实验方法
三、竞争法
此法常用于测抗原和半抗原，也用于测 抗体。以测抗原为例，将特异抗体吸附于 固相载体，加入待测抗原和酶标已知抗原， 使两者竞争与固相抗体结合，经过洗涤分 离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗 原含量呈负相关，即待测抗原和酶标抗原 颜色反应的差数是待测抗原的含量（图3）。
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源自文库
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第四.一部分: 人TNF-α检测实验原理
基本实验原理: 双抗体夹心ABC-ELISA法。抗人TNF-α单抗包
被于酶标板上，标本和标准品中的人TNF-α会与 单抗结合，游离的成分被洗去。同时加入生物素 化的抗人TNF-α抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 合素。生物素与亲合素特异性结合；抗人TNF-α 抗体与结合在单抗上的人TNF-α结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反 应孔中有人TNF-α，辣根过氧化物酶会使无色的 显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测A 值，人TNF-α浓度与A450值之间呈正比，可通过 绘制标准曲线求出标本中人TNF-α浓度。
125 62.5 pg/ml pg/ml
31.25 pg/ml
标准品稀释方法
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第四.四部分: 结果判断与计算
1、每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。 2、绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，OD值
作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
• 1、提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至 室温。
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
7、洗板4次。
8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a) 工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。
10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合 工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟.
11 、洗板4次.
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第四.二部分: 实验试剂、材料和仪器设备
• 实验标本 • 试剂盒及其内容物 • 实验材料 • 仪器设备
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实验标本
人外周血(血清) 1.收集血液的试管应为无热源和内毒素试管 2.血浆抗凝剂为EDTA 3.标本应清澈透明, 如有悬浮物应离心除去 4.避免溶血, 高血脂 5.标本收集后若不及时检测,按一次用量分装,冻存于
酶联免疫吸附实验(ELISA)
山东省医学科学院基础所免疫室
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第一部分: 基本实验原理
基本原理 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相
载体上，并保持其免疫活性，将待检标本 和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体 表面吸附的抗体或抗原进行反应，用洗涤 的方法分离抗原抗体复合物和游离成分， 然后加入酶的作用底物催化显色，进行抗 原或抗体的定性或定量检测。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
-20℃,避免反复冻融 6.可根据实际情况, 将标本作适当倍数稀释(建议做
预实验, 以确定稀释倍数)
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试剂盒及其内容物
1a 标准品1支(4000pg，冻干)4℃ 1b 标准品和标本稀释液(粉红色) 1瓶(15ml)4℃ 2a 浓缩生物素化抗体2/1支*(60μl)4℃ 2b 生物素化抗体稀释液（绿色）（15ml）4 ℃ 3a 浓缩酶结合物2/1支*(60μl)4℃(避光) 3b 酶结合物稀释液(黄色)1瓶(15ml)4℃ 4 浓缩洗涤液 20×(兰色)1瓶(15ml)4℃ 5 显色剂1瓶(6ml)4℃ 6 终止液1瓶(12ml)4℃ 抗体包被板条8×12 或 8×6 4℃ 封板胶纸1张
说明书1份 *:[96/48 Test]
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实验材料与设备
1.加样器: 0.5-10ul, 2-20ul, 20-200ul, 2001000ul
2.吸头: 10ul, 200ul,1000ul 3.酶标仪: 450nm 4.双蒸水或去离子水, 坐标纸等
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第四.三部分: 实验方法与步骤
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图3: 竞争法测抗原示意图
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第三部分: 方法的特点和进展
ELISA方法由于灵敏、特异，操作简便、 快速，实验设备要求较为简单，应用范围 广泛，无放射性污染等优点，成为目前普 及应用最广，发展最快的免疫学技术之一。 生物素-亲合素系统（BAS）是在ELISA中 应用的常见技术（BAS-ELISA），其中 ABC- ELISA法更为常用，其基本原理为， 固相抗体+待测抗原+生物素化抗体+亲合素 -酶标生物素复合物+底物显色。
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第二部分: 常用实验方法
一、间接法 此法常用于测抗体。将已知抗原吸附于
固相载体，加入待检标本（含相应抗体） 与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗球蛋 白抗体（酶标抗抗体）和底物显色进行测 定（图1）。
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固相抗原 酶标抗抗体
待测标本(含相应抗体)
图1: 间接法测抗体示意图
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第二部分: 常用实验方法
12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。
13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。
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500μl std.
500μl 500μl 500μl 500μl 500μl
2000 pg/ml
1000 pg/ml
500 pg/ml
250 pg/ml