基因工程概论-85页精选文档

基因工程概论连接产物●重组分子●未连接的载体分子●未连接的D N A片段●载体的自连●含有错误插入片段的重组D N A分子1转化—细菌吸收D N A的方式自然界中，转化并不是细菌获取遗传信息的主要方式。

细菌必须经过物理或化学处理后可提高吸收D N A的能力，经过这样处理的细菌称为感受态。

1.1大肠杆菌感受态的制备●感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

1.1大肠杆菌感受态的制备●在冷的盐溶液中转化效率提高。

一般利用50m M的C a C l2，或者氯化铷。

–原理：与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，并发生收缩，使细胞膜出现孔隙。

●42°C热激处理。

1.2筛选转化细胞1n g的p U C8可以产生1000-10000个转化子，意味着只吸收了0.01%的D N A分子。

1.3其他的转化方法●电穿孔驱动的完整细胞转化（电激转化法）●接合转化●微注射法●λ噬菌体的转染●P E G介导的细菌原生质体转化1.3其他的转化方法●电激转化–受体细胞在脉冲电场作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得D N A分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。

–可以转化较大的质粒，适用于所有的细菌。

1.3其他的转化方法●接合转化–是由接合型质粒完成的。

–涉及到三种菌株的混合：受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及含有待转化重组质粒的供体菌。

–重组质粒和接合质粒必须有相容性。

1.3其他的转化方法●P E G介导的细菌原生质体转化–高渗溶液中细菌培养至对数生长期–溶菌酶的等渗液处理，形成原生质体。

–加入D N A样品和聚乙二醇等渗液–离心除去聚乙二醇，固体培养。

●适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性菌、酵母、霉菌甚至植物。

表5-1大肠杆菌5种常用转化方法的比较2重组子的鉴定●利用插入失活选择p B R322重组●载体：含有β-半乳糖苷酶基因l a c Z的调控序列和头146个a a的编码序列●宿主：缺失了l a c Z’基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列●α-互补：l a c Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。

基因工程概论重点知识：遗传工程、基因工程的概念；基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现；基因工程的基本步骤；基因工程的意义。

难点知识：基因工程的概念；基因工程的基本步骤；基因工程的基本原理。

第二章基因工程的工具酶重点知识：同位酶；同裂酶；同尾酶；星号活力；DNA操作酶的功能及应用（Bal 31, E. coli外切酶III,S1核酸酶，DNase I,测序酶，DNA连接酶，DTD, Ligase,逆转录酶，碱性磷酸酯酶，甲基化酶）；限制性内切酶的分类、命名原则；电泳后DNA的检测方法；DNA分子量的估算方法；怎样提高平头末端的连接效率；如何实现目的基因与载体连接效率；提高重组率的方法；构建酶切图谱的方法。

难点知识：DNA操作酶的功能及应用；怎样提高平头末端的连接效率；如何实现目的基因与载体连接效率；提高重组率的方法；构建酶切图谱的方法。

第三章基因克隆的载体重点知识：载体；克隆载体；表达载体；穿梭载体；质粒；严谨型质粒松弛型质粒；cos位点；λ cI突变体；溶源/溶菌性噬菌体；粘粒（cosmid）；噬菌粒；2μm质粒；载体的基本要求；质粒的基本特征及其分类；λDNA的特点；M13作为载体的优点；如何测定DNA的浓度和纯度？质粒DNA的提取方法，纯化的原理与方法；噬菌体DNA的分离纯化方法；大肠杆菌质粒pBR322、pUC8、pGEM3Z-DNA的特点；不同载体克隆DNA的片段大小；M13、λDNA作为载体需要进行哪些改造？λ克隆载体的类型；建生物基因组文库需要克隆的数目；酵母克隆载体的类型；YAC载体包括那些结构，来源和构建方法。

难点知识：严谨型质粒松弛型质粒；粘粒（cosmid）；噬菌粒；M13、λDNA作为载体需要进行哪些改造？λ克隆载体的类型；建生物基因组文库需要克隆的数目；YAC载体包括那些结构，来源和构建方法第四章重组DNA的转化与筛选重点知识：感受态细胞；插入失活；α-互补；Spi+；转化的方法有哪些？转化效率如何；噬菌体DNA转化大肠杆菌的方法；重组噬菌斑的鉴定方法；重组DNA的鉴定方法。

第一章基因工程第一节基因工程的概述【学习目标】1、简述基因工程的概念含义，简述基因工程的诞生历程，认同基因工程的诞生和发展离不开理论突破和技术创新2、简述基因工程的原理，说出DNA重组技术的基本工具及其作用、特点，简述基因工程基本操作程序，以及各步骤的一般方法、原理，模拟重组DNA分子的操作过程【课前预习】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，在通过人工和等方法，对生物的基因进行和，然后导入并使重组基因在中表达，产生人类需要的基因产物的技术。

因而又叫DNA重组技术。

基因工程是在水平上操作、改变生物遗传性状的技术，包括基因的、以及在受体细胞内的和过程。

2、为基因工程的创立作出了重要的理论铺垫，而的发现，则直接促进了基因工程的诞生。

1973年，美国科学家将不同来源的两种DNA分子体外重组，并首次实现了在大肠杆菌中的表达。

3、“分子手术刀”：。

其作用的特点是：其产生的DNA末端有两种形式：和。

“分子针线”将双链DNA片段缝合起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的。

4、“运载工具”。

通常利用质粒作为载体。

作为载体必须具备以下条件：载体DNA必需有一个或多个的切割位点；载体DNA必需能在受体细胞中；载体DNA必需带有特殊的基因。

5、基因工程的基本操作步骤包括：①②、③、④6、PCR是一项在生物复制特定DNA片段的核酸合成技术。

目的基因受热形成，与结合，在的作用下延伸形成DNA。

【共同探究】【思考题1】（10全国2）下列叙述符合基因工程概念的是A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上（一）DNA重组技术的基本工具1、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。

基 因 工 程5 2 3 4 167 基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程的基本条件基因工程的操作过程目的基因的分离克隆大肠杆菌的基因工程真核酵母的基因工程5目的基因的分离克隆5目的基因的克隆A 鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断超声波处理：全酶切：部分酶切：与载体连接鸟枪法克隆目的基因的基本战略转化受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子鸟枪法操作的改进使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA鸟枪法操作的改进在连接前将DNA片段进行分级分离1.8 kb鸟枪法操作的改进凝胶DNA片段回收技术鸟枪法克隆目的基因的局限性B cDNA 法5 目的基因的克隆cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA 法分离目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性cDNA法克隆目的基因的基本战略c DNA第一链的合成mRNApppG G AAAAAAAAAAAAAA OHpppG G AAAAAAAAAAAAAA OHTTTTTTTTTTTTTT p pppG G AAAAAAAAAAAAAA OHTTTTTTTTTTTTTT pcDNA第一链自身引导法：AAAAAAAAAAAAAAppp G GAAAAAAAAAAAAAA OH TTTTTTTTTTTTTT p TTTTTTTTTTTTTT p 5’TTTTTTTTTTTTTT p5’AAAAAAAAAAAAAA OH 3’TTTTTTTTTTTTTT OH 3’Klenow dNTPsS1置换合成法：ppp G GAAAAAAAAAAAAAA OH TTTTTTTTTTTTTT p AAAAAAAAAAAAAA p AAAA TTT OH TTTTTTTTTTTTTT p TTTTTTTTTTTTTT OH AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTT引导合成法：pppG G AAAAA OHTTTTT pHOpppG G AAAAA CCCCCCC OHHO CCCCCCC TTTTT pHO CCCCCCC TTTTT pHO CCCCCCC TTTTT pp GGGGGGGHO CCCCCCC TTTTT pp GGGGGGG AAAAA OHcDNA法克隆目的基因的基本战略双链c DNA的克隆平头末端直接与载体连接，平头两端分别接同聚物尾，加装人工接头引入酶切口，cDNA法分离目的基因的基本程序完备分离程序cDNA法分离目的基因的基本程序特异分离程序cDNA法分离目的基因的基本程序差异分离程序差异分离程序多瘤病毒感染的FR3T3细胞正常的FR3T3细胞总mRNA总mRNAcDNA 双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆原位杂交病毒诱导表达的基因cDNA克隆cDNA法克隆目的基因的局限性C PCR 法5 目的基因的克隆PCR法定向扩增目的基因的基本原理PCR 克隆目的基因的基本程序PCR盒式引物扩增法PCR技术的诞生与发展PCR技术的诞生与发展聚合酶链反应PCR 扩增技术1985Kary mullis198819931995PCR法定向扩增目的基因的基本原理目的基因5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘底物聚合加热变性引物退火底物聚合123A T载体PCR克隆目的基因的基本程序AATT5’PCR扩增产物T载体T7lacZ MCS ori Ap r盒式PCR扩增法染色体DNA 5‘ 端不含磷酸基团D 化学合成法5 目的基因的克隆化学合成法的基本战略化学合成的单元操作DNA化学合成的用途全基因合成小片段粘接法：12-15全基因合成补钉延长法：12-1520-30化学合成法的基本战略全基因合成40-50化学合成法的基本战略全基因合成95% 507.7%探针等寡聚核苷酸合成简并密码子偏爱性探针等寡聚核苷酸合成Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn IleTGT ATG GAC GAA ATG AAA AGA AAC ATA C T G ATG G G T TCCGA CGG CGT CGC TG T ATG GA C GA I ATG ATG T ATG GA T GA I ATG ATG C ATG GA C GA I ATG ATG C ATG GA T GA I ATG AAGEST expressed sequence tag化学合成的单元操作基团保护分离缩合分离去保护磷酸二酯法磷酸三酯法亚磷酸液三酯法液相合成固相合成化学合成的单元操作O HG H H H H OCH 2O DMT PO Me N CH Me Me CHMe MeH DMT ： 二甲氧基三苯甲基缩合氧化脱取代基玻璃珠连接臂DNA化学合成的用途合成天然基因修饰改造基因设计新型基因制备探针、引物、接头5目的基因的克隆E 基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序基因库与基因文库基因库（gene pool ）基因文库（gene library or gene bank ）基因组文库cDNA 文库基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，用cDNA法构建cDNA文库，基因文库的完备性完备性NN = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )2.9 x 109bp15 kb0.945万0.9999180万基因文库的质量标准完备性重组克隆的总数不宜过大载体的装载量最好大于基因的长度克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选基因组DNA的制备基因组DNA的切割连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！载体和受体的选择基因组文库l-DNA cDNA文库质粒考斯质粒15 kb 25 kb 45 kbBAC300 kb YAC400 kb基因文库的构建程序从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因杂交挖取铺板铺板目的重组克隆基因文库构建的技术性问题严禁外源DNA片段之间的连接将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端5目的基因的克隆A 鸟枪法B cDNA法C PCR法D 化学合成法E 基因文库的构建。

一、简述基因研究所取得主要成就，及其与基因工程创立与发展的关系。

1、基因学说的创立孟德尔提出遗传因子学说到后来的摩尔根染色体理论，揭示了在染色体上基因的线性排列。

2、DNA是遗传物质从Avery的细菌转化实验到沃森和克里克揭示了DNA的双螺旋模型及半保留复制机理，表明DNA是遗传物质。

3、DNA是基因的载体4、基因是细胞中RNA及蛋白质的“蓝图”。

5、随着中心法则的提出和64种密码子的破译，基因碱基顺序与蛋白质氨基酸顺序得到对应。

6、随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展，人们对基因的分子结构有了进一步的认识。

7、随着操纵子模型的提出，人们对基因的表达调控有了进一步的认识。

8、随着基因分离与克隆技术的不断改良与发展，基因组文库、cDNA文库、分子探针、PCR 等技术不断被人们运用。

9、目前，不仅能够分离天然基因，还能结合化学合成等方法，在实验室内进行基因的合成、构建，并进行相应的表达分析。

基因工程是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上诞生的一门新兴学科，它的创立和发展，直接依赖于基因及其分子生物学研究的进步，基因及其研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础。

二、基因工程建立的三大理论基础和技术条件是什么？并简述其在基因工程中的应用。

1、三大理论基础：（1）1940年艾弗里（O.Avery）等人通过肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌；（2）1950年沃森（J.D.Watson）和克里克(F.Crick)发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理；（3）1960年关于遗传信息中心法则的确立。

2、三大技术条件：（1）限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现；（2）基因工程载体；（3）大肠杆菌转化体系的建立。

3、应用：通过限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以将切割得到的目的基因与载体连接在一起，经由大肠杆菌转化体系增值复制，为基因工程的后续研究提供基础材料。