酶联免疫吸附试验 PPT课件

酶联免疫吸附试验
（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)
ELISA的基本原理
①使抗原或抗体结合固相载体表面，并保持活性。 ②使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原。 ③在测定时，把受检抗体（或抗原）和酶标抗原（或抗体）按
不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体）起反应。
为酶标记抗原-抗体复合物。
4.酶催化底物并显色。
参
酶标抗原
考 管
YYY +
YYY +
YYY
待
酶标抗原
测 管
YYY +
YYY +
YYY
抗原
间接ELISA方法的建立
1、抗原最佳包被液的选择； 2、抗原、血清和酶标二抗工作浓度的确定； 3、封闭液的选择； 4、封闭时间的优化； 5、血清稀释液的选择； 6、抗原抗体反应时间的优化。
7、 酶标二抗：稀释HRP标记羊抗猪IgG，每孔100µL， 37℃作用30min； 8、洗涤； 9、显色：加新鲜配制的TMB底物液每孔100µL，室温 避光作用15min； 10、加终止液：加50µL 2mol/L硫酸； 11、读数：用酶标仪检测OD450值。
ELISA的优点：
血清学方法有很多种, 如传统的琼脂扩散( A G ID ) 、 血 凝抑制( H A / H I ) 、 乳胶凝集、 试管凝集、补体结合 等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。EILSA技 术与其有着不同的特点： 1、灵敏度高。ELI SA是通过酶促反应放大检测信号, 从 而提高检测的灵敏度, 其检测限可达 ng 甚至pg 水平, 可 做定量测定。 2、特异性强。ELI SA的每一步体的特异性识别过程, 结 构类似物、 有色物质、 荧光物质等对检测的影响很小。 3、样品的预处理过程和 ELI SA的操作步骤简单快捷， 有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可同 时检测数十甚至上百个样品。 4、设备简单，适用于基层。
+ 底物
显色
三、酶标抗原竞争法
竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原
和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗
原的量呈反比。
1.将抗体包被在固相载体上。
2.如样品中含有抗原，则优先竞争结合抗体，结合为抗原抗体复合物。
3.同时加入酶标记抗原，抗原没有结合的位点酶标记抗原去占据，则结合
（1）固相的抗原或抗体， （2）酶标记的抗原或抗体， （3）酶作用的底物。 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设
计出各种不同类型的检测方法。
一、双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。 4.酶催化底物并显色。
+ 固相抗体 标本
+ 酶标抗体
+ 底物
显色
二、间接法测抗体
间接法是检测抗体最常用的方法。操作步骤如下： 1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体
复合物。 4.酶催化底物并显色。
+ 固相抗原 标本
+ 酶标抗体
ELISA操作步骤
以间接ELISA为例： 1、包被抗原:用包被液将抗原稀释至合适浓度，加入到
酶标板中，每孔100µl，4℃过夜； 2、洗涤:弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次 3min，
最后用吸水纸拍干；
3、封闭：各孔加入封闭液200ul，37℃作用1h； 4、洗涤； 5、加被检血清：将血清样品稀释至最佳浓度，每 孔100µL，每个样本两孔，每块板同时设阴性、阳 性及空白对照各两孔，37℃作用30min； 6、洗涤；
④用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原（或抗体）， 最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量 成一定的比例。 ⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。 ⑥产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根 据颜色反应的深浅来定性或定量分析。
ELISAFra Baidu bibliotek类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定 方法中有三个必要的试剂：
ELISA的应用
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用 于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病 等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原 的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵 敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。 不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查 几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。 本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的 循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此 ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。