实验课题：用分光光度法测香肠中亚硝酸盐的含量
一、实验人员
二、实验目的
测定香肠中亚硝酸盐的含量。
三、实验原理
亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定。
利用碱性的硼砂将脂肪从样品中分离，利用乙酸锌及亚铁氰化钾使蛋白质变性分离。
试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，利用分光光度法来测定，最大吸收波长为540nm。根据朗伯比尔定律，并结合工作曲线，可以得到香肠中亚硝酸盐的含量(mg/kg)。
四、试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯水，为GB/T 6682规定的二级水或去离子水。
1、双汇王中王香肠一根（净含量：50g）
2、乙酸锌溶液(220g/L)：称取11g乙酸锌，先加1.5mL冰醋酸溶解,用水稀释至50 mL。
3、亚铁氰化钾溶液(106 g/L):称取5.3 g亚铁氰化钾,用水溶解,并稀释至
50mL。
4、饱和硼砂溶液(50g/L):称取2.50 g硼酸钠,溶于50mL热水中，冷却后备用。
5、亚硝酸钠标准溶液（10μg /mL）
6、对氨基苯磺酸溶液（1.0％）
7、盐酸萘乙二胺溶液（0.3％）
五、仪器和设备
1、天平：感量为0.1mg和1mg
2、研钵
3、分光光度计
4、电热炉
5、50ml烧杯1个、500ml容量瓶1个、50m容量瓶10个、胶头滴管、各个规格的移液管、玻璃棒
六、实验步骤
（一）试样的预处理：
1、取全部，用研钵制成匀浆备用。
2、称取5ｇ（精确至0.1 g）制成匀浆的试样置于50 mL烧杯中，加12.5 mL 饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70 ℃左右的水约300 mL 将试样洗入500 mL容量瓶中，80℃加热15 min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。
3、在振荡上述提取液时加入5 mL 亚铁氰化钾溶液, 摇匀, 再加入5 mL 乙酸锌溶液,以沉淀蛋白质。加水至刻度, 摇匀, 放置30 min, 除去上层脂肪, 上清液用滤纸过滤（用移液管吸取中间澄清的部分）。弃去初滤液30 mL,滤液备用。
（二）亚硝酸盐的测定
1、吸取40.0 mL 上述滤液于50 mL 容量瓶中，另吸取0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL 亚硝酸钠标准液（相当于0.0μｇ、5.0 μｇ、10.0μｇ、15.0μｇ、20.0μｇ、25.0μｇ亚硝酸钠），分别置于50mL 容量瓶中。
分别标号为“样品管”、“0号管”、“1号管”、“2号管”、“3号管”、“4号管”、“5号管”。
2、于标准容量瓶与试样容量瓶中分别加入2 mL 对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3 min～5 min 后各加入2mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 min.
3、用1 cm 比色皿，以“0号管”调节零点，于波长540 nm 处测“1号管”、“2号管”、“3号管”、“4号管”、“5号管”吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。
七．实验数据及结果分析
试管号0 1 2 3 4 5
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0
亚硝酸钠质
量（μｇ）
吸光度（A）
0.0000.1030.2130.3180.4070.521
测得样品吸光度为：0.042A
代入公式A=0.0207m+0.0016,得m=1.95μｇ
即所取40ml滤液中含有亚硝酸盐1.95μｇ，可折算出总试样处理液500ml中亚硝酸盐的含量为：
1.95μｇ/40*500=24.38μｇ
则此火腿肠中硝酸盐的含量为：
24.38μｇ/5g=4.88mg/kg
根据我国食品添加剂使用卫生标准在肉制品中亚硝酸盐的最终残留量不得超过30mg/ kg，测定结果为4.88mg/kg<30mg/kg,故样品合格。
资料显示双汇王中王火腿肠的硝酸盐含量为6.3326mg/kg，同此实验中另外小组所用试样来自同一根香肠，测定结果为：
误差分析如下：
1、亚硝酸盐易被氧化为硝酸盐，试验中加热的时间及温度需要严格控制。由于
本组取样时间较晚，样品研磨后在空气中暴露时间长；由于水浴锅不恒温，加热温度曾升至86℃，加热时间较长，故有一部分亚硝酸盐氧化为硝酸盐，可能使测定结果偏低。
2、比色皿配套性、各实验人员操作习惯等造成一定的系统误差。
3、虽为滤液，但仍含有一定杂质。杂质对光可能有一定吸收，同时其中较大的颗粒会产生散射光，使测定结果偏低。由于其他杂质多无色，吸收产生的影响较小，主要为一些悬浮的油滴散射的影响，故结果偏低。
实验操作中虽用移液管于油层下取液并进行过滤，但油脂并未除尽，当进行进一步处理。
4、可见分光光度法在测得吸光度为0.2-0.8之间时准确性较好。但实测样品的吸光度为0.042A，远低于下限0.2，则结果的精确度下降。
参考文献
[1]GB 5009.33-2010 食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定[S]
[2]GB 2760-2011 食品添加剂使用标准[S]
[3]田伟，陈志刚. 内蒙古科技与经济[M]. 内蒙古: 内蒙古科技与经济杂志社,2011
