一株高产蛋白酶芽孢杆菌的鉴定

附表 供试菌 BLS Y - 1 和其他芽胞杆菌的生理生化比较 A tta che d ta b le. Com p a riso n o f p hys io lo g ica l a nd b io chem ica l inde x be 2
tw e e n BLS Y - 1 a nd o the r B a c illu se s
研究报告
中 国 酿 造
2009年 第 9期
总第 210 期
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16S rRNA 序列的 PCR 扩增体系 : 以 BLSY - 1 的总 DNA 为模板 , 引 物 见 1. 1. 3, 反 应 体 系 为 25μL: 双 蒸 水 15. 5μL ,Mg2 + ( 25mmol/L ) 2. 0μL , dNTP ( 2. 5mmol/L ) 2. 0μL ,引物 一 ( 25μmol/L ) 1. 0μL , 引物 二 ( 25μmol/L ) 1. 0μL , TaqDNA 聚合酶 ( 5U /μL ) 0. 5μL , 10 ×buffer solu2 tion ( 20mmol/L ) 2. 5μL。反应条件 : 94℃预变性 5m in, 30 个 循 环 ( 94℃、30 s、53℃、1m in, 72℃、2m in ) 72℃ 延 伸 10m in。 2 结果与分析 2. 1 生理生化实验结果及分析
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由图 1可看出 ,对照菌株枯草芽孢杆菌菌落增长速度 比 YSBL - 1的快 。将枯草菌和 YSBL - 1菌接种到同一个 酪蛋白培养基平板上培养 ,枯草菌在酪蛋白平板上经历了 约 24h的适应期后 ,就开始较大幅度的增长 ,生长 84h后 , 其菌落增长速度开始变缓 ; YSBL - 1菌在酪蛋白平板上经 历约 36h的适应期后 ,才开始缓慢增长 ,其增长幅度没有 参照的枯草芽胞杆菌高 ,但是保持增长的时间比参照均菌 要长 。 YSBL - 1菌利用酪蛋白的能力比参照菌要强 。 YS2 BL - 1 菌随培养时间的增长 ,其透明圈也随之增大 ,而且 其增加幅度相对于参照菌而言要高很多 。参照菌在培养 了 36h后其透明圈直径的增大趋势略有降低 。而供试菌 在所培养的 108h内一直处于较好的增长趋势 。 YSBL - 1 菌和参照菌的菌落和透明圈的增长符合同步增长曲线的 基本规律 。
蛋白酶 ( p rotease)是催化肽键水解的一类酶 ,广泛存 subtillis) CCTCC AB93151:购于武汉大学中国典型培养物
在于动物 、植物和微生物中 ,执行许多不同的生理功能 。 保藏中心 ,经驯化处理保存于本校微生物实验室 ;感受态
蛋白酶种类的多样性和水解活性的专一性 ,使其在食品 、 大肠杆 菌 E. coli DH5a: 由 本 实 验 室 提 供 并 保 存 ; 质 粒
100mL ,调 pH 值为 7. 0, 121℃灭菌 30m in。 1. 1. 3 16S rRNA 引物
根据芽孢杆菌 16SrRNA 保守序列设计 ,上游 : 5’- CA2 GATGGGAGCTTGCTCCCTG - 3 ’ , 下游 : 5 ’ - CGACTTCAC2 CCCAATCATCTG - 3’,并由上海生工合成 。DNA 凝胶回收 试剂盒购自上海生工 , PCR 试剂购自 Takara 生物公司 。 DNA 测序由上海生工测序部完成 。 1. 2 方法
酪蛋白培养基 :干酪素 1. 0g,水解酪蛋白 0. 1g,琼脂
紧张素转换酶 (Angiotensin converting enzyme, ACE) 的活 2. 0g,将干酪素用 0. 5mol/L NaOH 微热溶解 ,加蒸馏水至
性 [3 - 4 ] ,同时可以获得酪蛋白磷酸肽 ( Casein phosphopep2 tides, CPPs) [4 ] 、玉米肽 [5 ]等对人体非常有价值的活性多 肽 。目前食品工业用酶主要来源于微生物 ,蛋白酶是食品 工业中应用最广泛的酶 ,能够提高食品的品质 、稳定性 、可 溶性等 。本研究分离获得了一株高产蛋白酶的芽孢杆菌 , 并通过菌株生理生化指标测试和 16S rRNA 分析对其进行 了初步鉴定 ,同时对其水解大豆蛋白的活力和特性也进行 了初步的研究 。
2009 No. 9
1 8 S e ria l No. 210
C h iBiblioteka Baidua B rew ing
Research Report
一株高产蛋白酶芽孢杆菌的鉴定
刘海军 1 ,乐超银 1 3 ,邵 伟 2 ,王 健 1 ,李金鞠 1 ,梁 薇 1
(1. 三峡大学生物技术中心 ,湖北 宜昌 443002; 2. 三峡大学 化学与生命科学学院 ,湖北 宜昌 443002)
摘 要 :通过经典生理生化实验和 16S rRNA序列分析 ,对新分离出的 1株高产蛋白酶的芽孢杆菌进行系统鉴定 。研究发现该菌 卵磷脂酶试验和马尿酸盐反应均为阳性 ,并在 60℃仍有蛋白酶活性 。将该菌 16S rRNA序列在 Genbank中进行 blast,发现其与枯 草芽孢杆菌 EHFS1 - S02Hc的 16S rRNA序列同源性高达 99. 63% ,分离出的高产蛋白酶芽孢杆菌可能为一新亚种或生物型 。 关 键 词 :菌种鉴定 ;芽孢杆菌 ; 16SrRNA;蛋白酶 ;水解特性 中图分类号 : Q 93 - 331 文献标识码 : A 文章编号 : 0254 25071 (2009 ) 09 20018 203
皮革 、洗涤剂等工业生产领域成为具有重要商业价值的工 pMD18 - T:购自 Takara生物公司 。
业用酶 ,据估计当前世界工业生产酶市值 10亿美元 ,蛋白 1. 1. 2 培养基
酶为工业生产酶三大类之一 ,其约占总市值 60% [1 ] 。利
LB 培养基 : 蛋白胨 1. 0g, 酵母提取物 0. 5g, 氯化钠
收稿日期 : 2008 - 12 - 25
基金项目 :中国博士后基金项目资助 (20060390775)
作者简介 :刘海军 (1984 - ) ,男 ,在读硕士研究生 ;乐超银 3 ,副教授 ,通讯作者 ,研究方向为分子生物学 。
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用不同的蛋白酶或相关的产酶微生物可以制备各种活性 0. 5g,琼脂 2g, 蒸馏 水 100mL , 1mol/L NaOH 调 pH 值 为
多肽 。有关研究表明 ,利用蛋白酶水解大豆蛋白 (或是直 7. 0, 121℃灭菌 30m in。
接用微生物发酵 [2 ] ) 获得的大豆多肽能够有效抑制血管
将 YSBL - 1 和枯草芽孢杆菌分别接种于水解酪蛋白 培养基上 , 37℃培养 ,并于不同时间观察其菌落直径和水 解透明圈的大小 ,结果见图 1。
图 1 菌落和透明圈随时间变化 F igu re 11C ha nge o f the s tra in co lo ny a nd tra n sp a re n t c irc le
菌种 特征
地衣芽 枯草芽 短小芽 多粘芽 浸麻芽 供试菌
胞杆菌 胞杆菌 胞杆菌 胞杆菌 胞杆菌
运动性
+
+
+
+
+
+
过氧化氢酶
+
+
+
+
+
+
厌氧生长
+
-
-
+
+
-
V. P反应
+
+
+
+
-
+
V. P中的 pH值 5. 0～6. 5 5. 0～8. 0 4. 8～5. 5 4. 5～6. 8 4. 5～5. 0 5. 6
+
+
+
+
+
木糖
+
+
+
+
+
+
甘露糖
+
+
+
+
+
+
淀粉水解
+
+
-
+
+
+
马尿酸盐
-
-
+
+
柠檬酸利用
+
+
+
-
b
+
丙酸盐利用
+
-
-
-
还原硝酸盐
+
+
-
+
+
+
酪素分解
+
+
+
+
-
+
酪氨酸分解
-
-
-
-
-
-
注 :“ + ”表示阳性反应 ,“ - ”表示阴性反应 。
对供试菌 BLSY - 1 进行镜检观察和革兰氏染色 ,可 以初步认定该菌属于革兰氏阳性芽孢杆菌 。其各项生理 生化指标检测结果与芽孢杆菌属的其他种 [6 - 7 ]进行比较 情况见附表 。
Abstract: An isolated B acillus strain w ith higher - yield p ro tease was identified system atically through the physio logical and biochem ical detection method and the 16S rRNA sequence analysis. The results showed that the B acillus strain had higher hydrolytic ability and showed positive lecithin2 ase, hippurate. The p rotease activity was still available under 60℃. The homology of 16S rRNA sequence of this strain was up to 99. 63% com2 pared w ith B acillus subtilis EHFS1 - S02Hc. Therefore, the identified B acillus strain m ight be a new subspecies or a biovariety of the species. Key words:m icrobial identification; B acillus strain; 16S rRNA; p ro tease; hydrolytic ability
( 1. B iotechnology R esea rch Cen ter, Th ree Gorges U n iversity, Yichang 443002, Ch ina; 2. College of L ife S cience and Chem istry, Th ree Gorges U n iversity, Y ichang 443002, Ch ina)
最高生长 温度 / ℃
50～55 45～55 45～50 35～45 40～50 60
最低温度 / ℃
15 5～20 5～15 5～10 5～20 10～20
卵磷脂酶
-
-
-
+
抗溶菌酶
-
b
a
-
b
-
在 pH5. 7中
+
+
+
+
+
+
NaCl( 7% )
+
+
+
-
-
+
抗叠氮化钠
-
-
-
葡萄糖
+
+
+
+
+
+
阿拉伯糖
+
Iden tif ica tion of h igh - y ield prote in produc ing B a c illus stra in
L IU Haijun1 , YU E Chaoyin13 , SHAO W ei2 , WAN G J ian1 , L I J inju1 , L IAN G W ei1
1 材料与方法 1. 1 材料
1. 2. 1 生理生化试验鉴定 参考细菌鉴定的方法 [1 ] ,并作相应的改进 。
1. 1. 1 菌种
1. 2. 2 16S rRNA 鉴定
BLYS - 1: 筛选自宜昌本地土壤 ; 枯草杆菌 (B acillus
BLSY - 1菌株的总 DNA 的提取 :采用 SDS法 。 [3 ]
由附表可以看出 ,将供试菌的生理生化指标和其他的 几种典型芽孢杆菌相比 ,发现该供试菌和枯草芽孢杆菌 、 地衣芽孢杆菌 、短小芽孢杆菌 、多粘芽孢杆菌及浸麻芽孢 杆菌有很大的相似性 ,而且更接近于枯草芽孢杆菌 。仅单 纯的生理生化指标而言 ,供试菌和枯草芽孢杆菌的生理特 性极其相似 ,但供试菌对马尿酸盐和卵磷脂酶的利用呈阳 性 ,而枯草芽孢杆菌是呈阴性的 。初步认为该供试菌可能 为芽孢杆菌属下的一个种或亚种 。 2. 2 供试菌蛋白酶水解能力的测定结果