一株高产蛋白酶芽孢杆菌的鉴定

实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离一、教学目标及基本要求1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。

枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。

由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。

但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。

例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。

又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。

1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。

由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。

2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。

利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。

根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。

3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。

有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。

菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。

在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。

菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。

4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。

1株边鸡源产蛋白酶枯草芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性研
究
孙丽萍;胡馨元;钮慧晶;王琴;裴彩霞;李毅;夏呈强
【期刊名称】《现代畜牧科技》
【年(卷),期】2024()2
【摘要】该试验旨在筛选具有高产蛋白酶能力的益生芽孢杆菌,扩大微生态制剂候选菌株资源。

以边鸡直肠内容物为分离来源,经脱脂奶粉平板初筛获得16株产蛋白酶菌株,液体发酵复筛后,选取1株蛋白酶活力高达119.7 U/mL的芽孢杆菌FRE76进行后续研究。

通过16S rRNA基因测序与进化树分析,并结合形态学与生理生化鉴定,判定该菌株为枯草芽孢杆菌。

病原菌抑制试验表明,该菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用。

耐酸和耐胆盐检测发现,在pH值3.0和4.0时该菌株存活率均为50%以上,在胆盐浓度为0.1%和0.3%时菌株存活率均能达到60%以上。

该试验筛选获得的枯草芽孢杆菌FRE76,具有优良的蛋白酶生产性能、较好的致病菌抑制能力和较强的抗逆性,是一株潜在的益生菌菌株。

【总页数】6页(P33-38)
【作者】孙丽萍;胡馨元;钮慧晶;王琴;裴彩霞;李毅;夏呈强
【作者单位】山西农业大学动物科学学院;山西农业大学生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】S831.5
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一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建是一个涉及微生物学、生物化学和分子生物学等多个领域的综合性实验。

以下是该实验的详细步骤：一、蛋白酶产生菌的鉴定1.观察菌落的形态和颜色：将待鉴定菌株接种在固体培养基上，观察菌落的形状、大小、隆起程度、颜色等特征。

与已知蛋白酶产生菌的菌落特征进行比较，初步判断待鉴定菌株是否为蛋白酶产生菌。

2.显微镜观察：将待鉴定菌株进行显微镜观察，观察其细胞形态、大小、排列方式等特征。

与已知蛋白酶产生菌的显微镜特征进行比较，进一步确定待鉴定菌株是否为蛋白酶产生菌。

3.生理生化实验：进行一系列的生理生化实验，包括碳源利用实验、氮源利用实验、生长曲线测定、氧化还原实验等，进一步确定待鉴定菌株是否为蛋白酶产生菌，并对其生长特性和代谢特性进行研究。

4.分子生物学鉴定：提取待鉴定菌株的基因组DNA，进行PCR扩增和序列分析，与已知蛋白酶产生菌的基因序列进行比对，确定待鉴定菌株的分类地位和系统发育关系。

二、蛋白酶性质研究1.蛋白酶的分离纯化：从待鉴定菌株中提取蛋白酶，通过离子交换层析、凝胶过滤等手段进行分离纯化。

2.酶活性检测：设置合适的底物浓度和反应条件，测定蛋白酶的活性，包括最适pH、最适温度、动力学常数等。

3.酶稳定性研究：在不同温度、pH等条件下，检测蛋白酶的稳定性，确定其应用范围和使用条件。

4.底物特异性分析：通过蛋白质印迹实验、底物特异性分析等方法，研究蛋白酶的底物特异性，为其应用提供依据。

三、表达载体构建1.目的基因获取：通过PCR扩增或基因组测序等方法，获取蛋白酶基因。

2.载体选择：根据目的基因的特点和应用需求，选择合适的表达载体，如质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。

3.载体构建：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。

可以采用DNA重组技术、定向进化技术等方法，对目的基因进行改造和优化。

4.转化宿主细胞：将重组表达载体转入合适的宿主细胞中，常用的宿主细胞包括细菌、酵母、昆虫细胞等。

一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定随着全球气候变化和人类活动的影响，盐碱化和荒漠化的问题日益严重。

盐碱土壤中的高盐浓度不但对植物生长带来影响，也对微生物生长带来极大的压力。

而在这样的环境中，若能筛选出一些耐盐菌株，对维护土壤生态平衡和提高农业生产力都有着积极的意义。

本研究采用土壤样品培养菌株与测序分析相结合的方法，筛选出一株耐盐蛋白酶高产菌，并对其进行初步鉴定和评价。

1、筛选菌株从渭南市半夏沟盐碱土壤中挖取样品，使用平板法选取耐盐菌。

筛选条件为：15%NaCl、pH=8.0、温度为37°C。

经过3个孔眼培养基的筛选后，获得了一株能够在高盐高碱环境下生长的菌株。

2、16S rRNA测序分析使用菌落PCR方法提取该菌株的基因组DNA，将其16S rDNA片段扩增并纯化，测序结果表明该菌株属于葡萄球菌属。

经过BLAST比对分析，其与NCBI数据库中的Staphylococcus arlettae的同源性可达到99.67%。

3、蛋白酶高产能力评价培养该菌株于含有1.5%NaCl的LB培养基中，经过48小时后采集细胞沉淀并测定其蛋白酶活性水平。

结果表明，该菌株可产生100U/mL的蛋白酶活性，具有良好的蛋白酶高产能力。

4、耐盐性评价在不同浓度的NaCl中对该菌株进行耐盐性评价。

结果表明该菌株最大耐盐浓度为18%NaCl，具有较强的耐盐能力。

5、蛋白酶酶学性质研究将该菌株的蛋白酶纯化并研究其酶学性质。

结果表明，该蛋白酶在pH=9.0~10.0和温度为50℃时具有最高酶活性，属于碱性蛋白酶。

综合上述结果可知，本研究筛选出一株具有较强耐盐能力和蛋白酶高产能力的Staphylococcus arlettae，对于盐碱土壤的改良和农业生产都具有重要的潜在应用前景。

一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定随着生物技术的不断发展，酶工程在生物技术领域中扮演着重要的角色。

蛋白酶是一类具有广泛应用价值的酶类，在生物工程、医药、食品加工等领域具有重要的应用价值。

目前市场上大多数的蛋白酶都是来源于微生物，因此寻找高产、耐盐蛋白酶的菌株成为了当前的研究热点之一。

本研究旨在筛选出一株耐盐蛋白酶高产菌，并对其进行初步鉴定和研究。

一、菌株的筛选1. 样品的采集样品是研究的基础，本研究选择了海水作为原料，海水中的微生物菌落丰富，是寻找耐盐菌株的理想来源。

在采集海水样品时，需要避免外界的污染，同时要选择距离海岸较远的地点进行采样。

2. 耐盐菌的筛选在采集得到的海水样品中，我们采用平板和液体培养的方法进行菌株的筛选。

首先将样品进行稀释，之后在含有不同盐浓度的琼脂平板上进行培养。

经过一段时间的培养后，观察并挑选出耐盐能力较强的细菌菌落进行复苗。

接着将耐盐菌菌液接种到含有不同盐浓度的液体培养基中，再次筛选出最适合耐盐性能力的菌株。

3. 蛋白酶产生菌株的筛选得到耐盐菌株后，我们将其进行蛋白酶产生能力的筛选。

将筛选得到的菌株分别接种到富含蛋白质的培养基中，之后进行培养和振荡，并使用凝胶电泳和光谱法检验菌株的蛋白酶产生能力。

二、菌株的初步鉴定1. 形态学鉴定接下来，我们对耐盐蛋白酶高产菌进行初步的形态学鉴定。

首先观察菌落的形态、颜色等特征，然后将其进行革兰氏染色和酸性染色等基本染色实验。

2. 生理生化特性鉴定在对菌株进行了形态学鉴定后，我们还需要对其进行生理生化特性鉴定。

菌株的氧气需求情况、产酶酶素的特性、温度和酸碱度的耐受能力等。

3. 分子生物学鉴定我们还将对该菌株进行分子生物学鉴定。

利用PCR扩增技术对其进行16S rDNA序列的测定和分析。

通过与NCBI数据库中已知菌株的16S rDNA序列进行比对，最终确定该菌株的属属和种属。

三、结论与展望经过以上几个步骤的研究和实验，我们筛选出了一株耐盐蛋白酶高产菌，并对其进行了初步的鉴定和研究。

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一株产胶原蛋白酶芽孢杆菌的分离及鉴定生物科学2003级李军指导老师吴琦副教授摘要：从皮革厂、畜肉市场、屠宰场等处采样，分离得到49株明胶水解活性的细菌。

经活性平板初筛、牛皮消化实验和活性测定，筛选得到一株胶原蛋白酶活性为35.97U/mL的菌株。

经形态学观察、生理生化特性和16SrDNA序列分析，鉴定该菌株为短小芽孢杆菌。

关键词：胶原蛋白酶，短小芽孢杆菌，分离，鉴定Isolation and Identification of a Bacillus pumilus withCollagenase ActivityLI Jun Biological Science, Grade 2003Directed by WU Qi (Associate Prof. )Abstract：Forty-nine bacterial strains with glutin hydrolyzation activity were isolated from leather house, market and slaughterhouse. By screening media, fresh calfskin decomposition and activity detection, one strain was screened with collagenase activity about 35.97U/mL. Furthermore, seen from morphology, physiology biochemistry characteristic and 16S rDNA sequencing, it was identified as a Bacillus pumilus.Key words：Collagenase，Bacillus pumilus，Isolation，Identification胶原蛋白或称胶原是由动物细胞合成的一种生物性高分子。

一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定
盐渍化是困扰全球农业持续发展的问题之一。

在高盐环境下，微生物为了适应环境，
往往会产生一些耐盐酶，这些酶具有广泛的应用前景，目前对这类酶的研究越来越受到关注。

本研究通过对芽孢杆菌菌株进行耐盐蛋白酶的筛选及鉴定，旨在找到一株高产耐盐蛋
白酶的菌株，为该类酶的产业化应用提供基础资料。

研究中使用了来自不同环境中的细菌菌株作为研究对象，经过耐盐筛选和试验验证，
筛选出一株产酶菌株。

该菌株的形态特征和生化特性表明，它属于芽孢杆菌属。

为了进一步了解筛选出的菌株的耐盐蛋白酶的生化特性，对该菌株产酶条件的影响进
行了初步研究。

结果表明，最佳的产酶条件为温度37℃，pH值为8.0，盐度为12%。

在此
条件下，该菌株耐盐蛋白酶的相对酶活达到了最高值。

此外，研究还分别分析了该菌株产酶过程中酶活力与时间、碳源和氮源等因素的关系，并对其酶解产物进行了初步的质谱分析。

结果表明，该菌株的耐盐蛋白酶主要是以胶原蛋
白为底物，可将胶原蛋白降解成小分子多肽和氨基酸。

现代农业科技2021年第15期食品科学摘要蛋白酶是一种重要的工业用酶制剂。

本试验从土壤中筛选出1株产蛋白酶水平较高的菌株S-3,通过生理生化鉴定和16S rDNA 基因序列分析,鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis )。

本试验为贝莱斯芽孢杆菌应用于蛋白酶生产提供了依据。

关键词蛋白酶;贝莱斯芽孢杆菌;菌种鉴定中图分类号TQ925.2文献标识码A 文章编号1007-5739(2021)15-0210-03DOI :10.3969/j.issn.1007-5739.2021.15.086开放科学(资源服务)标识码(OSID ):Isolation and Identification of a Protease-producing StrainWANG Shuai WANG Nannan XIANG Jiale SUN Dongmei *(School of Life Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing Heilongjiang 163000)Abstract Protease is an important industrial enzyme preparation.In this experiment,a strain of S-3with a high level of protease production was selected from the soil,and it was identified as Bacillus velezensis through physiological and biochemical identification and 16S rDNA gene sequence analysis.This experiment provided a basis for the application of Bacillus velezensis in protease production.Keywords protease;Bacillus velezensis ;strain identification一株蛋白酶产生菌的分离及鉴定王帅王楠楠向佳乐孙冬梅*(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江大庆163000)蛋白酶是一类能催化肽键水解成氨基酸或短肽的酶类,广泛存在于动物、植物和微生物中,有着许多不同的生理功能[1]。

土壤中产蛋白酶芽孢杆菌的筛选一、实验目的要求1、了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术2、掌握从土壤中筛选产蛋白酶菌株的原理及方法3、学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法4、培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力二、实验基本原理土壤微生物类群在全球自然生态系统中具有不可替代的作用，它推动着生态系统的能量流动和物质循环，是生态系统的重要组成部分。

芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，多数为碱性菌，主要分布于土壤、动植物体及水体中。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

从而得到所需的菌株。

并且自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。

水解圈与菌落直径的比值，被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。

三、实验材料和试剂器具和其他用具：盛有9ml无菌水试管4支、培养皿10个、锥形瓶250ml、500ml各一个、无菌移液管4根、吸管、玻璃涂棒、电子天平、水浴锅、恒温培养箱、烧杯、报纸、土壤样品、高压灭菌锅、记号笔、显微镜、载玻片、盖玻片、酒精灯、接种环、尺子。

试剂：蛋白胨、牛肉膏、Nacl、琼脂、脱脂奶粉、酵母膏、葡萄糖、(NH4)2SO4、MgSO4.7H2O、K2HPO4、香柏油、二甲苯。

（注：牛奶平板、牛肉膏蛋白胨培养基、淡薄培养基）革兰氏染色：革兰氏染色、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红复染液芽孢染色：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液1、取样在家畜饲养的地方，从地表下10~15cm的土壤中用无菌小铲取土样，并记录取样的地理位置。

2 、采集取一小方土样均匀在纸上，然后再纸的四角和中心各取2g土壤样品，混匀形成10g土样。

3 、灭菌将10g土样放入100ml无菌水中并置于250ml的三角瓶中，然后放入水浴锅中加热（80℃）处理10min。