生物化学检验常用技术

⑤应用范围窄 主要用于碱金属和部分碱土金属的测定
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影响火焰光度分析的因素
1、激发条件
火焰温度要适当，温度过低灵敏度下降，温度 太高则碱金属电离严重，影响测量的线性关系。
2、试样的种类和组成 3、试液中共存离子对测定有影响 4、仪器的质量
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（二）、荧光分光光度法
荧光的定义：
某些物质受紫外光或可见光照射 激发后能发射出比激发光波长较 长的光。
发射光谱是指样品本身产生的光谱被检 测器接收；吸收光谱是光源发射的光谱 被样品吸收了一部分，剩下的那部分光
谱被检测器接收。
火焰光度法
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荧光光度法
（一）、火焰光度法
火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测 元素所发射的辐射强度来进行定量分析的方法。 它是一种简化的发射光谱分析法
FP640火焰光度计
当化合物含量太少,一般分析方法灵精敏品文度档不够时,使用荧光分析技术就能解决测定问题。
三、散射光谱分析法
光的散射
用单色光照射透明溶液时，大部分按原来 方向透射，而一小部分则按不同的角度散
透射光 I
T = I/I0
T×100%为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光 度即：
A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I
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2、Lambert-Beer定律
当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层 厚度和溶液浓度成正比。
A = KLC
A 为吸光度；
K 为比例常数，称为吸光系数；
火焰光度法分析示意图
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火焰光度法的特点
①快速
试样溶液于数分钟内可完成测定
②准确
火焰光源稳定性高，干扰少，误差为2％~5 ％，可用于微量分析和常量分析
③灵敏
分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达 0．1～10×10－6 g
④设备简单
被测试样易被火焰激发，产生的谱线较简单，且 均在可见光区，故使谱线分离和测量的设备简单
单色光 均匀介质
吸收物质无相 互作用
4、Lambert-Beer定律的偏离现 象
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5、空白溶液的选择
在分光光度法中，为消除显色剂及样品中各种共存有色物质产生的 干扰、抵消比色皿和试剂对入射光的影响而用来调节仪器百分透光率为100% 的溶液。
不
蒸
馏 水
试
样
剂
品
含 待 测 元
不
显 色
素
1、溶剂空白：不加样品和任何试剂，用纯溶剂（如蒸馏水或其他有机溶剂）作参比溶液。 选择原则：当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其他有色离子时，选用溶剂参比。
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(二)、分光光度法在生化检验中的应用
灵敏度高、操作简便、应用广泛
1、对未知化合物进行定性分析
定性依据： 最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε
2、对待测物质进行定量测定
标准曲线法和比较法
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(1).标准曲线法
方法：
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围 内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液 （浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法 作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度 为横座标，以吸光度为纵座标，将对应各点连成一条通 过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定 吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。
荧光产生的原理：
化学物质能从外界吸收并储存能量 （如光能、化学能等）而进入激发态， 当其从激发态再回复到基态时，过剩 的能量可以电磁辐射的形式放射（即 发光）。
荧光分光光度法
利用物质吸收较短波长的光能后发 射较长波长特征光谱的性质，对物 质定性或定量分析的方法。
分析测定蛋白质、核酸、维生素等; 对某些激素及其代谢产物的测定;
2、试剂空白：用不加样品，而显色剂和其他试剂都相同的溶液作参比溶液。 选择原则：当显色剂本身有颜色或其它试剂有颜色，被测试样中又无其他有色离子时，选用试剂参比。
3、样品空白：用不加显色剂的样品溶液作参比溶液。 选择原则：当试样溶液有颜色，而试剂、显色剂均无颜色时，选用样品空白。
4、平行操作空白：按样品分析完全相同的操作步骤，用不含待测元素的样品进行平行操作， 以消除操作过程中引入干扰杂质所带来的误差。
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5.标准溶液设置的浓度范围足够大。
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2．比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测 定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接 计算出标本的浓度，计算公式为：
CR=(AR ×Cs)/As
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二、发射光谱分析法
处于激发态的待测元素，原子回到 基态时以辐射的形式释放出能量，由此而产 生的光谱称为发射光谱，对元素进行定性与 定量分析的方法。
选择原则：当操作过程中由于试剂、器皿、水和气等因素引入了一定量的被测试样组分的干扰离子
5、不显色空白：可将一份试样加入适当的掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂 和其它试剂均按照操作手续加入，以此作为参比溶液，这样可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。
选择原则：当显色剂和被测试样均有颜色时，可选用此法。
第三章
生物化学检验常用技术
基 因 扩 增 技 术
电 泳 分 析 技 术
干 化 学 分 析 技 术
电 化 学 分 析 技 术
光 谱 分 析 技
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第一节 光谱分析技术
吸收光谱分析技术 发射光谱分析技术 散射光谱分析技术
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一、吸收光谱分析法
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0.575
光源
钨灯、卤钨灯 350～1000 氢灯、氘灯 180～360
单色器
滤光片 棱镜 光栅
吸收池 检测器
玻璃比色皿 石英比色皿
显示器
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(一)、分光光度技术的基本原理
1、吸光度与透光度
当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一
部分光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I， I和I0之比称为透光度，即：
入射光 I0
L 为溶液层厚度，称为光径；
C 为溶液浓度
L
Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体
Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层
厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。
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3、Lambert-Beer定律的应用条 件
Lambert-Beer定律适用于: 可见光、紫外光、红外光和均匀非散射 的液体以及分散均匀的固态或气态样品.