生化反应曲线

17
两点终点法
在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸 光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两 点吸光度之差用于计算结果。
18
Endpoint assays
两点终点法的特点 去除了样本的本底
采用两个测量点
针对两个或多个试剂的项目
第一个读数点一般选在添加最后一个试剂之前
第二个读数点一般选在加入最后一个试剂之后且已经达到了反应终点
▪ 1st entry: ▪ 2nd entry: ▪ 3rd - 6th entry:
方法类型 总分析时间 测量点
27
Endpoint assays 一点终点法分析项目举例
TRIGL
CHO
28
三点终点法
即双终点法,在一个通道内一次进行两项反应相关的终点 法测定.
ABS
15
17
t 35
例如,多项同测组合试剂盒,CHO与TG同一测定
换算成 Abs/min参与计算 在加入最后最后一个试剂之后进行吸光度检测。
38
Rate assays 2-point Rate assay – Modular P
39
Rate assays 2点速率 法-分析项目举例
Ammonia Acid phosphatase
Urinary/CSF protein
12
Reaction sequence
13
Instrument cycle
Mod P
Sample pipetting 1st
Reagent 1
1st
2nd reagent
5th
3rd Reagent
16th
4th reagent
33rd
C 501 Cycle No
1st
C702 1st
1st
1st
A (样本) + B (试剂)
C + D (显色产物)
24
Endpoint assays 单试剂一点终点法的反应曲线1-point endpoint assay – one reagents
25
双试剂一点终点法的特点（1-point endpoint assay – two reagents）
▪ 不包含样本的本底 ▪ 仅进行一点测量
生化反应曲线
1
内容概况
生化分析基本原理 生化反应曲线
2
罗氏生化分析系统产品线
Cobas c111 180T/H
Cobas c311 300T/H
Cobas 6000 (c501) 600T/H
Modular P 800T/H Modular D 2400T/H
3
Cobas 8000 2000T/H
Roche Diagnostics (Shanghai) Limited Shanghai 200031 China
COBAS and LIFE NEEDS ANSWERS are trademarks of Roche
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A (样本) + B1 (试剂1) + B2 (试剂 2)
C + D (显色产物)
19
Endpoint assays
两点终点法的反应曲线–Cobas c702
Mp1 abs before addition of R3
Sample+R1
Mp2 abs at reaction end
20
2Point Endpoint assay application settings 两点终点法的应用参数 – Cobas c702
Urea
Non-prostatic phosphatase Bicarbonate
40
Reaction Direction
上升decreasing 或 下降increasing
41
生化反应曲线
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
Thank you for your attention
适合于任何均匀非散射的介质
生化比色分析 特定蛋白透射比浊分析
7
Roche Hitachi Photometer
8
Reaction sequence
当相应的比色杯每一次通过光路系统时，光路系统会测量并记录 下相应的吸光度 ▪ 光路系统可以测量后分光后12个波长的相应吸光度。 12 有效波长: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800nm ▪ 多数检测项目都使用双波长检测方法。（可去除干扰物对检测结果 的影响）
t1 t2 t3 t4 t 时间
利用线性反应期，计算出单位时 间的吸光度变化△A/min，来计算酶 的活性。
31
速率法（Endpoint assays）
▪ 速率A法 （Rate A） ▪ 两点速率法（2-point Rate）
32
速率A法
在较长的反应时间区段内,每隔一定时间读取一次吸光度值,至少读 取4点,得到3个△A,求出单位时间的反应速率 △A/min .
方法类型
总反应时间（min） 测量的两个读数点
两点读数的时间点: 第19点测量包含了样本和试剂1的本底
sample + reagent 1
第 38点在加入所有试剂后，反应达到终点
sample + reagent 1+ reagent 2
21
Endpoint assays 两点终点法分析项目举例
通过最小二乘法（least squares method）
A 单试剂速率法 例如:ACP\AFU
B 双试剂速率法 例如:ALT\AST\CK…
33
Rate assays Rate A assay – Modular P
Reag. at R3 timing
Sample Reag. at R1 timing
尿素氮
2点速率法
36
Rate assays 2-point Rate assay
A (sample) + B1 (reagent 1) + B2 (reagent 2)
C + D (product)
Enzyme
37
Rate assays 两点速率法的特点2-point Rate assay
采用一种或多种试剂 检测两个测量点检测固定的间隔时间内两点的吸光度变化。
Endpoint and rate (kinetic) assays
15
终点分析法
基于 被测物质在反应过程中到达反应终点或平衡点，根据该
点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法。
吸光度 S+R1
• 终点法的计算：
A1
t 时间
从时间-吸光度曲线来看，到达反应 终点时，吸光度将不再变化。在达到 终点时任取一点进行测定，此时底物 和产物的量都不再变化。
29
终点法反应的方向（Reaction Direction）
上升 increasing 或 下降decreasing
30
速率法
在酶促反应过程中,在反应速度恒定期(线性反应期)来连续观察和记录一定 反应时间内底物或代谢产物变化速度的化学方法.
吸光度
△A3 △A2 △A1
S+R
单位时间的吸光度
A1
变化量是一致的
RF-II
Biblioteka Baidu
C4
C3
ASL
CRPL
IGG
IGA
IGM
22
一点终点法
在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时 选择一个终点吸光度值，用于计算结果。
A单试剂一点终点法 例如:CHOL/TG….
B双试剂一点终点法 Mg(双试剂)…
23
Endpoint assays
单试剂一点终点法的特点（1-point endpoint assay – one reagent） ▪ 不包含样本的本底 ▪ 仅进行一个点的测量 检测项目举例：甘油三酯（TG）
10
7000
Bichromatic Difference
6000
5000
Absorbance
4000
3000
2000
1000
0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 cycles Bichromatic Difference
9
7000
Reaction Monitor Trig
6000
5000
Absorbance
4000
3000
2000
1000
0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 Cycles primary λ
57
16
终点分析法（Endpoint assays）
▪ 两点终点法（2-point end） ▪ 一点终点法 （1-point end）
一点终点单试剂（1-point endpoint assay – one reagent） 一点终点双试剂（1-point endpoint assay – two reagents） ▪ 三点终点法（3-point end）
应用项目举例： Magnesium
不采用两点终点法主要是样本和R1体积相加 仍<180uL(最小反应体积，无法测量）
A (sample) + B1 (reagent 1) + B2 (reagent 2)
26
C + D (product)
一点终点法应用参数（1 Point Endpoint assay） Utility - Application - Analyze
11th
7-8th
34th
19-20th
n/a
n/a
时间 T0 = 0 min T1 ≈ 0 min T2 (≈ 1.5 min) T3 (≈ 5.0 min) T4 (≈ 10 min)
14
自动生化分析常用的方法有:
▪ 终点法（End Point Assays）：一般在整个反应完成后再来检测吸光度 ▪ 速率法（Rate assays） ：一般在反应的过程中监测吸光度的变化情况
☆其数学表达式：A = e*C*L
I0
I
=
透射光 light d=etector
5
根据Lambert- Beer定律来计算待测物浓度
如若吸光系数 (ε )未知，我们就需要采用定标曲线 来计算待测物的浓度。
此值为定值
Concx =Δ Absx x Concs Abss
Concx = 待测样本浓度
70 60 待测样本 50 40 30 20 10
Concs = 标准品浓度 Δ Absx = 样本吸光度 Abss = 标准品吸光度
Calibrator/standard 标 准品 (cfas)
(amount of color)
吸 光 度
1
2
3
4
浓度 (amount of substance)
5
6
6
Lambert-Beer 定律
分光光度法定量分析的依据 Lambert-Beer 定律
cobas® 8000 模块化组合分析系统 智能、高效、强劲
4
物质对光吸收的基本定律－ Lambert- Beer定律
-------光吸收的基本定律
Lambert－Beer定律表达为:
当一束平行的单色光通过含有均匀吸光物质的溶液时,溶液 的吸光度(A)与溶液的浓度(C)和光透过液层厚度(L)的乘积成正 比。物质对光吸收的吸光系数（e）为常数。
1st. mp 34
Last mp
Rate assays
速率A 法-分析项目举例
GOT/AST GPT/ ALT ALP Amylase CHE CKMB
GGT Lipase GLDH LDH
Enzymes
35
2点速率法
指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦 非终点吸光度，这两点的单位时间吸光度差值用于结果计算。
11
仪器读数的原理
反应转盘不停的周期旋转 当相应的比色杯通过光路系统时，光 路系统会测量并记录下相应的吸光度
在不同的时间点加入相应的反应试剂
不同仪器每个循环周期的时间间隔 Modular P 18秒 Cobas c702 16秒 Cobas C501 8秒 Modular D 12秒 C311 12秒