【培训课件-临床色谱质谱检验技术】_液相色谱质谱技术(一)

《临床色谱质谱检验技术》
第五章 液相色谱质谱技术
主要内容
《临床色谱质谱检验技术》
一、本章教学要求 二、液相色谱质谱联用技术概述 三、液相色谱质谱联用仪系统 四、液相色谱质谱联用方法建立（一） 五、小结与思考
《临床色谱质谱检验技术》
一、本章教学要求
第五章教学要求
Ü 目标
Ü 掌握：
Ü 液相色谱-质谱联用仪的组成 Ü 液相色谱-质谱联用方法的建立 Ü 液相色谱-质谱联用技术临床应用的要求
液相色谱质谱联用的接口
Ü 液相色谱质谱联用的“接口”技术发展的三个分支
Ü 流动相进入质谱以后直接离子化，形成连续流动快速原子轰击技术等； Ü 流动相雾化后“去溶剂”，分析物蒸发后再离子化，形成“传送带式”接口和离
子束接口等； Ü 流动相雾化后形成的小液滴去溶剂化，气相离子化或者离子蒸发后再离子化，形
液相色谱质谱联用技术出现的原因？
Ü 已知化合物中约80%的化合物是亲水性强、挥发性低的有机 物，热不稳定化合物及生物大分子，只能依靠液相色谱进行 分离。
高分离能力 适用广
高灵敏度和高特异性
液相色谱质谱联用技术发展史
Ü 1912 J. J. Thompson（英国剑桥大学）研制出世界上第一台现代意义质谱仪 Ü 30's-50's 相继研制出双聚焦质谱仪、电磁扇形质量分析器质谱仪、四级杆质谱仪、飞行
时间质谱仪 Ü 1960's 开发气相色谱质谱联用仪 Ü 1974 E.C. Horning将大气压化学离子化（APCI）用于液相色谱质谱联用 Ü 1984 John Fenn发明电喷雾离子化技术（ESI） Ü 1988 电喷雾离子源质谱仪首次应用于蛋白质的分析 Ü 1989 第一台商业化电喷雾源的液相色谱质谱联用仪诞生 Ü 1990 Gary J. Van Berkel将离子阱质谱与ESI成功联用 Ü 20世纪90年代以后，液相色谱质谱联用广泛应用于各个领域，特别是在临床检验上的应用
Ü 熟悉：
Ü 液相色谱-质谱联用仪的工作原理 Ü 液相色谱-质谱联用的接口问题 Ü 液相色谱-质谱联用技术在临床方面的应用
第五章教学要求
Ü 教学形式及学时
Ü 理论教学学时：5学时 Ü 实践教学学时：6学时
《临床色谱质谱检验技术》
二、液相色谱质谱联用技术概述
复习
Ü 气相色谱质谱联用技术的定义？优势？应用局限？
液相色谱质谱联用方法建立步骤
样品 采集
样品 制备
分析 测定
数据 处理
样品处理 方法建立
色谱方法 建立
质谱方法 建立
信息及文 献检索
信息及文献检索
项目背景、目的及临床意义 目标物分析 全面了解检测方法的国内外现状 项目可行性评估 初步的实验方案设计
成本预估，以及实验所需耗材、试剂、设备等请购
项目背景、目的及临床意义
也得到长足发展。
《临床色谱质谱检验技术》
三、液相色谱质谱联用仪系统
液相色谱质谱联用仪的组成
1、液相部分（包括输液系统、进样系统、色谱柱、柱温箱） 2、质谱部分（包括离子源、质量分析器、检测器和真空系统） 3、数据处理系统
数据处理系统
液相部分
质谱部分
液相色谱质谱联用仪的组成及工作原理
质谱部分
Ü 数据处理（计算机）系统可以同时控制液相色谱、质谱部分、以及数据采集和 处理分析，是液相色谱质谱联用仪的中央控制单元。
成热喷雾接口、大气压化学离子化和电喷雾离子化技术等。
《临床色谱质谱检验技术》
四、液相色谱质谱联用方法建立（一）
液相色谱质谱联用技术在临床检验领域的主要应用
Ü 遗传代谢病（血氨基酸和酰基肉碱） Ü 内分泌疾病（类固醇类激素） Ü 营养素监测 Ü 毒理学和滥用药物监测 Ü 疼痛管理 Ü 治疗药物监测（免疫抑制剂等） Ü 蛋白质鉴定和定量
（3）去除流动相中杂质对质谱可能造成的污染
液相色谱质谱联用的接口问题
Ü 解决思路
Ü 扩大MS真空系统的抽气容量 Ü 在引入真空系统之前除去溶剂 Ü 分流流出物，牺牲灵敏度 Ü 使用可在较低流量下有效工作的微型色谱柱
Ü 对“接口”要求
Ü 接口不破坏MS真空系统，同时不影响色谱柱的分离柱效； Ü 接口使分离的组分尽可能多进入MS，同时让尽量少的液体流动相进入质谱； Ü 接口不改变分离后组分结构（样品不被分解损失）。
Ü 标本类型
Ü 全血：化合物主要与红细胞结合（如：环孢霉素A、他克莫司） Ü 血清/血浆：化合物主要与蛋白结合（如：霉酚酸） Ü 尿液：化合物及其代谢物在尿液中含量高（如：毒品） Ü 唾液：化合物在血中以游离状态存在 Ü 头发：慢性中毒
目标物分析—外源性化合物
Ü 采样相色谱质谱联用？
液相色谱质谱联用的主要困难
液相（LC） 高压液相操作（流速大） 液体进入离子源转变为大量气体 质量范围无限制 常常使用无机盐缓冲剂
质谱（MS） 要求高真空 只允许有限的气体进入离子传输系统 测定质量取决于m/z和质谱仪的类型 需采用挥发性缓冲盐
（1）如何解决样品从常压下液态分子到真空下气态离子的问题（降低色谱与质谱 间的工作压力差） （2）去除流动相，保留样品，电离化合物
Ü 定义：将气相色谱的分离能力与质谱的鉴定能力结合起来进行定性 定量分析的基本分析技术。
Ü 优势：既解决了气相色谱定性的不专一性，也解决了质谱要求样品 纯度高的局限性，二者优势互补，将气相色谱作为进样系统，质谱 作为检测器。
Ü 局限：适合分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物（仅占 已知化合物20%），但不适用不稳定和不挥发性物质分析。
Ü 对怀疑用量不足、疗效不好或观察疗效者一般应测定谷浓度，采血时间为早上用 药前。
Ü 对超量使用或怀疑出现毒副反应者一般应测定峰浓度，采血时间根据测定的药物 的达峰时间进行采集。
Ü 患者处于无发作也无中毒表现的稳定状态时，采血时间可为随机的，但间隔一定 时间复查时应与前一次测定时采血时间相一致。
Ü 以高苯丙氨酸血症（HPA）的鉴别诊断为例
背景：临床上一般不进行HPA鉴别诊断即治疗 目的：对HPA进行鉴别诊断 临床意义：可以对HPA进行针对治疗
目标物分析—外源性化合物
处方药
药物滥用
水环境
外用软膏
空气环境
膳食补充剂
目标物分析—外源性化合物
Ü 目标及数量
Ü 原药浓度或代谢物浓度？一种或多种？