图位克隆原理 PPT

• 密度： 每 6.6kb 存在一个
SNP
= single nucleotide polymorphism
• 单核苷酸多态性
• 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异 所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性 只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个 碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入 或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种 情况。(后面两种情况的多态性一般归为InDel）
STEP1: 把目标区域内的Marker序列贴进TAIR 网上的Seqviewer上搜索目标区域
MPK6 FP:
AATCTTGTAATCTGGTGCGTG
• 点击目标区域
• 密度： 每 3.3kb 存在一个
SSLPs
父本染色体
F1
母本染色体
假设：
F1
Aa 突变位点
Bb Marker
突变为 隐性突变
F1 配子
长根 长根
长根 长根
长根 短根
长根
长根
短根
短根
F2 短根个体
Col 单带
Ler单带
Col Ler 双带
• 因为F2代根据表型来筛选个体时，我们人工选 择的是短根表型，选择的个体为短根aa，即突 变位点不可能存在交换，交换率= 0
• 20.00%
4.76%
12.5% 12.5% 36%
筛选 F2 代 短根 移栽
3周左右
提基因组
各对引物PCR
统计计算Rf
步骤总结
缩小范围 寻找新Marker 扩大群体 (筛选重组子)
什么是重组子
• 在突变位点附近区域内绝大部分 的样品跑样结果都应该为只有非 重组的Col条带，即记录Rf为0， 只有少数的样品存在交换，Rf记 为1。
• 图中的6、12号样品即为重组子
筛选重组子的目的
• 在筛选出6、12号两个重组子以后，假设 在目标区域内寻找到新的标记引物，就 不需要把所有的个体跑样，只需要跑重 组子个体
• 例： Rf Marker1 Marker2 Marker3
6号个体
1
0
1
12号个体 1
0
0
表格的跑样结果显示Marker2最接近突 变位点，Marker3次之，下一步可以 在Marker2和Marker3附近寻找新标 记引物
包含来自于 Ler两条染色 体区段
**
Col
* ** * * **
1、4、8、10、11、13、15、18、19共9个 样品，只包含来自于亲本Col的染色体区段， 没有发生交换
**
*
Ler
5、6、14共3个样品，只包含来自于亲本Ler的 染色体区段，也就是发生了两次交换
** * * * **
Col Ler
6/100
4/100
(10/(100×2 )) ×100%=5cM
分子标记M3与突变位点的遗传距离：
4/100
(4/(100×2 )) ×100%=2cM
如何分辨来自于两个亲本的染色体？
M4
m4 目前最常用的分子标记
是利用两个亲本中同一
染色体区段的长度差异
来设计的，如左图亲本
Ler的M4处染色体区段长
比较产物长度
• CAPs
= cleaved amplified polymorphic sequences 酶切扩增多态性
利用酶切位点
Marker: MIG5-B
HC C
L
• dCAPs = derived CAPS 设计引物引入错配碱基，从而引入酶切位点
其它标记
InDel
= insertion-deletion 插入缺失标记，指的是两 种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲 本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量 的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失 位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR 引物，这就是InDel标记。 部分SSLP就是由 InDel转化而来
• 其他位点可能存在交换，利用带型差异判断交 换次数
Ler
Col
wild type
假设： Aa 突变位点 有5个Marker
mutant 杂交
图中的两个亲本不但在 A/a位点有差异，在其他 位点也存在大量的遗传 差异，可以利用这些差 异设计分子标记，对染 色体的具体区段进行标 定。在该例子中，该染 色体上总共确定了5个分 子标记，标定了5个不同 区段。
2、3、7、9、12、16、17共7个样品，包含1个 来自于亲本Col的染色体区段以及1条来自于亲 本Ler的染色体区段，即发生了一次交换
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• 突变位点与分子标记M的遗传距离：
交换次数 配子总数
×100%
3×2 + 7
= 19 × 2
×100% ≈34 cM
SSLPs
SSLPs
• 40.48% • 4.76%
于亲本Col中m4染色体区
段，在该差异位点两侧
设计引物经PCR扩增后得
到的PCR产物就会有不同
长度，电泳后M4泳动速
度慢，m4泳动速度快，
因此通过电泳就可以分
辨来自于两个亲本的染
色体区段
注意后两种情 况反映的是来 自于两个配子 的染色体区段 的情况
包含来自于 两个亲本的 染色体片段
包含来自于 Col 两 条 染 色体区段
在拟南芥的众多生态型中最常用的三种是 • Landsberg erecta(Ler) • Columbia(Col) • Wassilewskija(Ws)
• 其中Col生态型用于拟南芥的全基因组测序。
Marker
SSLPs CAPs dCAPs InDel SNP
• SSLP
= simple sequence length polymorphisms 简单序列长度多态性 又称 SSR= simple sequence repeats
F1 plant
假设： 只存在单交换
自交
F2 plants
只有左侧三种植株会选入定位群体
分子标记M5与突变位点的遗传距离：
M5处发生交换的植 株包括三种情况
10/100
6/100
4/100
(20/(100×2 )) ×100%=10cM
假设： 统计100个个体
分子标记M4与突变位点的遗传距离：
重组子筛选
1. 建议使用一对位于相对确信的区域内的 次低重组率标记引用来筛选 2. 可以根据情况调整用来筛选 重组子的Marker 3. 要选择好用、绝大部分一次 就能扩出来的标记引物
引物寻找
• 1.山大丁老师 提供的引物 • 2.TAIR网上提供的常用Marker • 3.AMP上提供的常用Marker • 4.TAIR网上公布的所有多态性位点资料