高效液相色谱法基本知识培训化验员入门培训

（三）热稳定性好
这一点在气相色谱中很重要。每种固定液有最高 使用温度。例如十八烷作为固定液时,只能在常温 下使用,但十八烷基键合相的流失温度在200℃以 上。在HPLC中,热稳定必也有一定意义,因为某些 分离是升温条件下进行的。
（四）表面改性灵活,容易获得重复性的产品
改变键合用有机硅烷,可以得到不同键合相的填料, 以适用于各种类型的试样分离,有助于提高分离选 择性。
特点
（一）柱子不“娇”
化学键合相是借助于化学反应的方法,将有机分子 以共价键连接在色谱担体上。因此,在很大程度上 减弱了表面活性作用点,清除了某些可能的催化活 性,从而减少了复杂样品的表面上的不可逆化学吸 附,使得操作简化、峰形对称、对溶剂中微量水分 含量的变化要求不苛刻。此外,溶剂的残留效应小, 梯度冲洗平衡快,和液-固色谱相比较,流动相可用 价廉的甲醇-水混合液。
容量因子(k’)
容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数, 它是样品组分的质量在两相中分配的比值,定义为
k’=固定相中溶质的质量(ms) = k・Vs
流动相中溶质的质量(mm)
Vm
VR=Vm+k’(Vm/Vs)·Vs= Vm+k’Vms = Vms·(1+k’)
式两边除以冲洗剂流速Fc则得
tR = tM(1+k’)
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
（二）耐溶剂冲洗 这是传统的液-液分配色谱逐渐被键合相色谱 (bonded phase chromatography,BPC)取代的根本 原因。在现代液相色谱发展的初期,常和气相色谱 一样,把有限的几种固定液,例如β、β’-氧二丙腈、 聚乙二醇、角鲨烷等涂渍的担体表面上,用一种性 质相差很大的溶剂冲洗,进行LLC分离。由于两种 完全互不相溶的溶剂体系实际上几乎不存在,因而 在LLC中固定液相的流失就十分严重。为了克服 这个缺点,曾采用流动相预先被固定液饱和,以及柱 前增加预饱和柱的方法,但这样做既不方便,柱系统 的稳定性也差。化学键合相是通过化学反应将有 机分子键合到担体上,因而具有不可抽提性,也就是 不存在固定液流失问题,使得柱寿命大大延长,并且 扩大了可用溶剂的范围。
具氢键接受体和给予体两种性能。对于有 较强氢键作用力的样品,在后两种键合相上 所得的k’就大。如联苯胺和苯胺，在正相洗 脱的条件下,在氨基固定相上所得的k’比氰 基固定相显著增大。
极性键合相一般都用作正相色谱,即用非极性或极性 小的溶剂(如烃类溶剂)加入适量的极性溶剂(如三氯 甲烷、醇、乙腈等),以调节控制洗脱液的洗脱强度。 分离组分的出峰顺序与组分的极性大小顺序相同,即 极性弱的先出峰,极性强的后出峰。但对强极性的化 合物,上述极性键合相也可用反相色谱,如在分离糖类 或多肽化合物时,用乙腈-水作洗脱液也可以得到良好 的分离效果。
少固定相粒径，可以提高柱效，相应的柱压增高，可进行快
速分离。第三，提高容量因子（k’）方法提高分离度，可通 过以下方法实现：（1）调节流动相极性、pH值、离子强度 等；（2）梯度洗脱。另外，如果k’值过大，会造成分离时间 过长，并且谱带扩散严重，因此，比较适宜的k’值范围为 1≤k’≤10。
拖尾因子T
离子性键合固定相的交换容量与固定相的
表面积直接有关。全多孔微粒型固定相的 交换容量，一般在毫克当量的水平；薄壳 型由于表面积较小,一般只有微克当量级。 交换容易可用酸碱滴定法测定。
在化学键合的有机硅烷分子中带上固定的离子交 换基团,便成了离子交换键合相。若带上磺酸基(SO3H)、羧酸基(-COOH)就是阳离子交换剂，若 带上季铵基（-R4H+)或氨基（-NH2)就是阴离子 交换剂。
上述离子交换键合相,多以薄壳型或全多孔 微粒硅胶为基质,具有较高的耐压性、化学 与热稳定性。由于硅胶有好的机械强度,耐 压,这类微粒型键合固定相可以高压匀浆装 柱。但它对pH的适用范围只能在pH0～8。 pH>9硅胶便容易溶解。特别是未键合的残 留硅羟基容易生成硅酸盐。
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
高效液相色谱法
第一节 高效液相色谱 的定义及基本参数
定义
高效液相色谱法系采用高压输液泵将 规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱， 对供试品进行分离测定的色谱方法。注入 的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组 分在色谱柱内被分离，并依次进入检测器， 由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
基本参数
（一）保留值 保留值是用来描述样品组分在色谱柱
某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出
所需流动相体积,一般情况下常以ml为单位。细内 径柱和毛细管柱,由于所需流动相流量很小, FC的 单位用μ1/min表示,此时VR可采用为μ1单位。
不保留物质流出时间以tM表示,又称死时间。 而tM・FC即为保留物质死体积,简称死体积(VM)。 死体积不仅与柱结构有关,而且与进样系统、检测 系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时, tM ・FC才表示柱内流动相所占的体积。以VM表示。 任何色谱过程的基本保留方程式为VR=VM+KVS式 中,K为平衡分配系数, VS为固定相体积,Vm为柱内 流动相所占体积(当柱外体积不容忽略时,Vm表示 柱内空隙及柱外体积之总和)。
分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按 键合相的表面结构为单分子键合和聚合键 合；按性质分为Si-O-C,Si-O-Si-N,Si-O-S-C； 按键合有机硅烷的功能团分为极性键合相、 非极性键合相和离子性键合相三种。
极性键合相色谱
极性键合相指键合有机分子中含有某种极性 基团。和空白硅胶相比,这种极性键合相表面上能 量分布相对均匀,因而吸附活性也比硅胶低，可以 看成是一种改性过的硅胶。最常见的极性键合相 有氰基（-CN，cyano-)、二醇基(diol)、氨基（NH2，amion-）等。商品键合相以上述基团命名, 如LiChrosorb NH2,LiChrosorb DiOl等。也有的 商品键合相并不注明是什么基团,而是称为Vydac polar(即氨基)或BondapaK Carbohydrate(也即氨 基)等。
调整保留时间和调整保留体积
扣除死时间或死体积的保留值,定义为调整保 留时间(t’R)和调整保留体积(V’R),如下式所示。
t’R =tR-tM V’R =VR-VM 保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱 操作条件一定时,不同物质的有其特定的保留值。 这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中,由 于流动相参与了溶质分配过程,因此,样品组分的保 留值不仅与固定相的性质有关,而且受流动相性质 变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成 对保留值的影响,是分离条件最佳化的基础。
大多数情况下,极性键合相的制备分二步进
行。第一步是在硅胶表面先接上一个正烃 基或正芳基硅烷,然后再以相应的取代反应 引入极性基团。由于空间位阻的影响,上述
取代反应往往不能象均相溶液中反应那样 完全,一般靠碳和氮含量来计算表面覆盖程 度。
上述三种极性键合相都是主要以氢键力作
用,其中氰基是一种氢键接受体,而后二种兼
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
2.分离度（R）
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离
物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能 的关键指标。可以通过测定待测物质与已 知杂质的分离度,也可以通过测定待测组分 与某一添加的指标性成分(内标物质或其他 难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品 用适当的方法降解,通过测定待测组分与某 一降解产物的分离度,对色谱系统进行评价 与控制。
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
用于评价色谱峰的对 称性。为保证分离效 果和测量精度,应检查 待测峰的拖尾因子是 否符合各品种项下的 规定。
重复性
用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重 复性能。采用外标法时,通常取各品种项下 的对照品溶液,连续进样5次,除另有规定外, 其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 2.0%；采用内标法时,通常配制相当于80%、 100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内 标溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别至少 进样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏 差应不大于2.0%。
无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标 峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外, 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。
计算公式为：
首先，可以通过增加分离因子（α）值的方法提高分离度，可 通过以下方法实现：（1）改变流动相的组成；（2）改变流 动相的pH值；（3）改变固定相的种类；（4）改变分离温度。 其次，提高理论板数（N）可以提高分离度：（1）柱长增加1 倍，柱效也增加1倍，但相应的分离时间也增加1倍；（2）减
溶质的色谱保留行为主要是由该溶质 在固定相和流动相中的平衡分配系数K所决 定的,而K是溶质在两相间达到平衡分配时 性质上的度量。其定义为,溶质在两相间达 到平衡时在固定相和流动相中的浓度比。
K= 溶质在固定相中的浓度(ms/Vs) = ms ・Vm 溶质在流动相中的浓度(mm/Vm) mm Vs
式中,ms、mm分别为溶质在固定相和流 动相中的质量。
对极性键合相来讲,一般键合表面的基团是 由三部组成:
键型 如Si-O-Si-C或Si-O-Si-N。这是整个极 性键合基团与硅胶母体直接相连的桥梁。
主体基团 一般由直链烃基或醚基所组成,其 作用为使在硅胶表面与特定的极性基团之 间保持一定距离。
极性的端基 由带极性基团(如NH2、OH)的 烃基或芳基所组成。
在极性键合相上的分离机理,有吸附和分配之争。但 一般都认为吸附过程是主要的相互作用过程,通过填 料表面极性基团的偶极诱导,或氢键,或静电作用和溶 质分子发生相互作用,达到混合物的பைடு நூலகம்离目的。
离子交换键合相色谱
离子交换色谱早期都采用高分子聚合物(如苯乙烯 -二乙烯苯)为基质的离子交换树脂作固定相。在 高效液相色谱中,这种固定相由于溶胀性,不耐高压, 以及表面的微孔型结构影响传质速率,现已逐渐被 离子交换键合相所代替。
第二节 化学健合相 色谱
在液相色谱中,液一液分配色谱,(liquidliquid chromatography,LLc)具有较高的分 离效能和温和的色谱条件。但最大的缺点 是担体表面涂渍的有机液相容易流失,并污 染分离后的组分。化学键合固定相是克服 这一主要缺点而产生的。它的出现,使得以 液-固吸附色谱和液-液分配色谱为主要操作 模式的液相柱色谱大量地被键合相色谱所 取代,某些离子型化合物也改用了离子交换 键合相或反相离子对色谱进行分离。因而, 化学键合相色谱是现代液相色谱中的一个 重要方法。