ＲAW２６4、７细胞株得相关信息
ATCC：美国模式培养物集存库(Aｍｅrican tｙｐe ｃulｔure cｏllｅcｔion)得简写
收到冷冻管细胞得处理方式
1、收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管就是否有解冻情形, 若有请立即通知。
细胞株请尽速开始培养,或立即冷冻保存(置于–70℃,隔夜后，移到液氮)。
2、收到T25 flask细胞得处理方式
于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡,Ｔ２5 fｌasｋ均加满培养基。
２、1、检查flａsk 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况与有无污染现象,若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。
２、２、将原封之Ｔ25 fｌask 静置于３７℃, 5% CO２培养箱中,使细胞回温至３7℃，并让运送过程中少数脱落得细胞可再附着生长.
２、3、隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，（取出之培养基可以再使用）,
仅留约5—10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘, 则将细胞做传代培养。
ＲAW2６4、7细胞株得ＣelｌCuｌｔure
一、RAW２64、7细胞培养得特点
1、RＡW2６4、7细胞一般为圆形或椭圆形,功能活跃时，可呈多突形。
细胞核为圆形或椭圆形,染色较深。
贴壁特别牢固。
２、RＡW264、7具有很强得吞噬能力,当吞噬抗原后,细胞会释放趋化因子,进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。
细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形,镜下会瞧到具有细长伪足得小细胞被类似上皮得梭形大细胞取代。
3、每次传代都很难消化下来.用力过大则对细胞损伤较大,这种细胞传代时接种密度要大,否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化,细胞变成长形，并且不能回复,这就是培养这种细胞时最需要注意得问题。
４、对于ＲAW264、7细胞她得声场时喜欢结伴。
正常生长状态应该就是一小片一小片得生长,片片之间不连接，等到长到更多更密得时候会连成大片,并且会叠加成层。
所以,要很好地控制好细胞得生长速度，不要等到叠加成层得时候再传代。
５、RAW２６4、7细胞传代后贴壁时间较短，半小时就能贴很多，刚贴壁就是细胞呈圆形,折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。
生长一段时间后,部分细胞会变成类似四角形,伸出伪足之类得．这个时候就就是提醒您注意传代了,这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉．
二、RＡＷ2６4、7细胞传代
1) 将培养瓶内旧得培养液弃掉, 然后用Ｄ—Hanｋs液洗两次，（一定要洗干净，以免影响胰酶得消化作用）
2) 加入０、2５％胰酶—EＤＴＡ消化,２5cｍ培养瓶加0、4mｌ, 37度消化5miｎ,镜下瞧到细胞变圆，间隙增大.(值得注意得就是该细胞对机械损伤比较敏感)
3）立即加含1０%FＣＳ得培养液终止消化，用细胞刮刀轻刮，注意,这时候用吸管吹不下来,但就是刮刀却很容易刮下来,而且对细胞得损伤极小
4）离心,弃上清,加新得培养液(10％ＦCＳ),小心吹匀,分装入新得培养瓶
三、ＲAW2６4、７细胞冻存及复苏
（一）细胞冻存
１、配制冻存培养液；(通用得为培养基:血清：ＤＭＳO＝7:２：１,但其中得血清可进行调整,如上面得仁兄用得４：５：１，比例过高)
2、取对数生长期得细胞（冻存前一天换液），用胰蛋白酶把单层生长得细胞消化下来，悬浮生长得细胞则直接将细胞移至1５ml离心管中；
3、离心1０00rpm,５miｎ;
4、去除胰蛋白酶及旧得培养液,加入适量配制好得冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数,调节冻存液中细胞得最终密度为５×106／ml~1×107/mｌ；
5、将细胞分装入冻存管中,每管1~１、5 ｍl(不超过冻存管容量得80％);
6、在冻存管上标明细胞得名称,冻存时间及操作者；
7、冻存:标准得冻存程序为降温速率—1~-2℃/ mｉn；当温度达-25℃以下时,可增至—5℃~—10℃/ｍin;到—1００℃时，则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞得冻存管放入－20℃冰箱2ｈ ,然后放入-7０℃冰箱中过夜,取出冻存管，移入液氮容器内.（具体操作为4°Ｃ 2０miｎ,—2０°C30mｉn,－７0℃过夜,转入液氮中）
(二) 细胞复苏
１、从液氮容器中取出冻存管,直接浸入3７℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
（1m ｉn以内溶解完毕，不能将口进入水面下）
2、从3７℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加1０倍以上培养液,混匀;
3、离心，１0０0rpm,5ｍｉn;
4、弃去上清液,加入含1０％小牛血清培养液重悬细胞,计数，调整细胞密度，接种培养瓶,3７℃培养箱静置培养;（复苏时细胞密度稍大,可提高复苏效率)
５、次日更换一次培养液,继续培养．(可更换一半培养液,避免跨度太大，影响细胞状态)
（三）接种
四、ＲAＷ264、7细胞形态不好时得处理方法
1、倒掉旧得培养基，加入3ml新得培养基（有无血清得都可）洗涤一次,用滴管吸走,然后再加入３mｌ得培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍,然后吸走。
这时侯再开始正式得消化、吹打。
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2、把吹打下来得细胞悬液加入到新得培
养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。
１０分钟观察一次,２0分钟,30分钟观察一次.选择一个时间点,已经有部分细胞贴壁得情况下,重新置于洁净台,底面朝上迅速倒出其中得培养基,加入3ml新培养基再轻轻洗一次。
然后加入完全培养基培养.后续观察细胞生长情况以及形态。
我称之为“二传”。
3、如果一次效果还不理想,可重复多次.直到找到细胞完美形态。
其中要注意,结合细胞喜欢得生长情况。
喜欢多一点数量长得好得细胞就等贴壁细胞比较多点得时候再传。
反之亦然。
不明之处：培养之前,一切与细胞接触得玻璃器皿与器具都要进行过去热源处理。
(2００-250℃烘烤4—6h)??
ＲAW２64、7细胞株CelｌＣulture得材料
（一)仪器
1、净化工作台
2、离心机
3、恒温水浴箱
４、冰箱(4℃、－20℃、—70℃）
5、倒置相差显微镜
6、培养箱
7、液氮冰箱
(二)玻璃器皿
1、吸管（弯头、直头）
２、培养瓶
３、玻璃瓶(２5０ml、100ml）
4、废液缸
(三）塑料器皿
１、吸头
２、枪头
3、胶塞
４、移液管(10ｍl)
5、１5ｍｌ离心管
6、冻存管（1～2ml)
（四)其她物品
1、微量加样枪
2、红血球计数板
3、记号笔
４、医用橡皮膏
5、移液枪
(五)试剂
１、D—Hankｓ液
２、胎牛血清
3、培养液
4、双抗(青霉素、链霉素)
５、胰蛋白酶(０、２5％)
6、7、４%NaHCO3
7、ＤMSO(分析纯)或无色新鲜甘油
附1、胎牛血清品牌整理
第一类,最高级别，就是专门用于干细胞得特级胎牛血清
1、Hyｃｌｏne得特级胎牛血清
目前，性能最好得血清,还就是要说说Ｈycｌoｎe得特级胎牛血清，货号就是ＳH30070、03,它就是Ｈycｌｏｎe得“招牌菜”。
ﻫHyclone特级胎牛血清(Ｄｅfine ｄFBＳ），货号SH30０7０,就是世界上唯一经过40纳米过滤得顶级胎牛血清，极佳得促细胞生长作用及产品稳定性。
内毒素含量≤10EU／mｌ,血红蛋白含量≤１0ｍg／dl。
此血清可以广泛用于各种细胞培养,包含任何干细胞系得培养。
2、Gibcｏ得特级胎牛血清ﻫ稍次一点得就是Ｇｉbｃo公司在美国原装生产得特级胎牛血清，这款血清，货号就是１6000－04４，就是1０0ｎm过滤3次，内毒素与血红蛋白含量都可以与Hyclｏne得SＨ30070、03相媲美.也可以用于培养大部分得干细胞系。
同样就是美国来源,所以渠道特殊。
３、ＴCB得特级胎牛血清ﻫTCＢ(Ｔissue Culture Biｏlｏgiｃａls）公司作为一家生物行业类得著名供应商,成立于1978年，大部分血清得采集与加工都在加利福尼亚。
每一批得原材料都经过严格筛选，所有得产品都在FＤＡ认证得cＧMＰ车间进行！ﻫ4、Ｂｉoiｎd特优级胎牛血清ﻫ血源来自北美与澳大利亚BiｏＩnd公司得生产完全符合GMＰ得要求,并通过ISＯ9０00：200１与ISO 13485:２003质量认证。
以安全,稳定，高效为原则得BioIｎd公司,所有得产品质量均完全符合国际标准。
Ｂｉological Induｓtries主营细胞培养类产品，B ｉｏInd工厂加工得胎牛血清均符合USDA标准及欧洲标准血清。
根据美国农业
部标准,原始血清均采自未发生疯牛病（BSE)与口蹄疫(ＦMD）疫情得国家。
B ｉological Inｄustriｅs三步滤菌处理法,最后得过滤步骤为连续通过三个100纳米得滤膜。
血清生产得洁净级别为１００级。
所有分装工作台都通过高效微粒空气过滤器过滤，并保持正压分装环境要对总微粒、悬浮微粒数与压力进行监控。
分装之后,终产品迅速-20度冻存，并隔离,直到所有得质量控制检测完成。
第二类，优等胎牛血清
1、Hｙclone得加拿大优等胎牛血清ﻫ性价比最高得就是Hyclone加拿大优等胎牛血清(CharａcterizendFBS)ＳH30３96、0３血清采自加拿大,由hyclｏｎｅ公司总部得员工采集加工，采集方法,加工过程，检定标准与美国原产优等胎牛血清完全一致,市场价格低于美国原产得。
经过3次100nm过滤，内毒素含量≤25EU/ml，血红蛋白含量≤2５ｍg/dl
2、Hyｃloｎe得南美优级胎牛血清ﻫ大体与加拿大得优等血清就是一样得，级别也非常相似,货号就是sv30０87、02,该胎牛血清来源于南美洲,以封闭得心脏穿刺方式采集，产品经３次100nm过滤,经严格检测确保无支原体,细菌病毒检测依据美国药典(ＵSP)与美国联邦法规第九篇（9CＦＲ)，内毒素含量≤10 EＵ／ml,血红蛋白含量≤２０ｍg/dl,完全符合美国HyCｌonｅ&rｅg；优等胎牛血清
3、Gｉbｃo得澳大利亚胎牛血清ﻫ情况与Hycｌone得澳大利亚得检测标准．ﻫ
胎牛血清差不多,市场价也就是３200元/5０0mｌ左右。
这一级别得血清,也能用于干细胞培养，可就是，不象特级胎牛血清那么优秀。
因为，此胎牛血清属于澳大利亚生产得,不在疫区,可以正常报关进口,目前没有受到任何影响，所以,就目前而言，算就是最好得胎牛血清了,有不少客户都此血清
4、TCB得优级胎牛血清
来培养干细胞,效果还就是比较不错。
ﻫ
情况与Hycｌone得澳大利亚胎牛血清差不多,市场价也就是２300元/500ml左右。
这一级别得血清,也能用于干细胞培养,可就是,不象特级胎牛血清那么优秀。
1、Hyｃlone得南美胎牛血清ﻫ目前,市场上用第三类,一般级别得进口胎牛血清ﻫ
得最多得Hyclone血清就是南美胎牛血清（FBS）SＶ3０087 ,此血清采自南美,在国内（兰州)过滤并测试检验，经三次100纳米过滤，根据中国商标法得规定标贴中文标签，内毒素含量≤10EＵ/ｍl,血红蛋白含量≤２0mｇ/d。
ﻫ此血清广泛用于各种肿瘤细胞得培养，还没有资料记载能够用于干细胞,也听说有少数人用
于干细胞培养得,不过,因为本身血红素比较高，所以,最好不要用于干细胞,ﻫ２、Gibco得南美胎牛血清ﻫ这款血清，就是Ｇibco针对Hyｃｌｏnｅ南美胎牛血清做得,价格比较贵,好像就是1780元/５00m。
3、Ｇｅmini得胎牛血清
4、ＴＣＢ得胎牛血清
5、ＰAＡ得胎牛血清ﻫ
6、ＪＲH澳洲胎牛血清
第四类,国产得各种系列胎牛血清ﻫ国产得胎牛血清,国内没有严格意义得胎牛血清,胎牛血清本身就是需要穿刺取血得,而国内都就是剖腹产出胎牛,8小时左右取血，然后,进行过滤分装.
所以，国产得胎牛血清不就是严格意义得胎牛血清。
ﻫ价格便宜但就是遇到得问题非常多。
附2、Ｈyｃlone液体培养基
货号标记说明:
“●”表示常规生产产品。
“○" 表示按客户订单生产产品，有一定得最小定制量并需要一定时间。
“□"表示未储存类项目，需要一段时间供给。
货号后标有“B”得为赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司生产，其她得为美国原产．附３、文章中得写作。
