干细胞技术在糖尿病的治疗应用--娄晋宁

胰腺
胰腺切除
手术切除胰
门静脉
干细胞胰岛移植
人干细胞分化胰岛移植到糖尿病 大鼠肝脏后的血糖变化
40 30 20 10 0
移植后时间
G ly c e m ia (m M ) C-peptide(ng/ml)
G lycem ia(m M )
干细胞分化胰岛移植后的功能评价
Glycemia
25
N1
20
N2
N3
干细胞分化胰岛的功能鉴定
胰岛素染
G ly c e m i a（ m M）
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
1
3
5
7
10
14
21
Time（day)
血糖变化
干细胞分化胰岛肾包膜下移植
肾包膜
干细胞移植
研究初步结论
１．人胚胎胰腺干细胞适合于临床糖尿病的治疗应用。
２．人胚胎胰腺干细胞技术是比较成熟的治疗技术。 ３．人胚胎胰腺干细胞分化胰岛治疗糖尿病是安全的。
4. 人胚胎胰腺干细胞治疗糖尿病的移植部位还有待确定
干细胞分化胰岛移植后的功能评价
Glycemia
20
Cell Number(x104)
600000 500000 400000 300000 200000 100000
0 Mouse Rat Monkey man
小鼠
大鼠
No.1
猴
人
No.2
人胚胎胰腺干细胞的体外培养
干细胞培
诱导成胰岛样结
1. 胚胎组织的选择： 早期胚胎组织的干细胞体外增殖能力强
2. 促进干细胞增殖： 高密度接种 成纤维细胞生长因子（bFGF）的应用
干细胞技术治疗： 1）干细胞的建立技术 2）干细胞的分离纯化技术 3）干细胞体外扩增技术 4）干细胞的定向诱导分化技术 5）治疗机制明了-细胞替代治疗
干细胞治疗： 1）干细胞分离技术 2）无干细胞体外扩增技术 2）无干细胞的定向诱导分化技术 3）治疗机制尚不明了
干细胞功能是否修 机制是否为替代治
治疗糖尿病所需要的干细胞数量
干细胞技术在糖尿病的治疗应用
娄晋宁 中日友好临床医学研究所
邓宏魁 北京大学生命科学院
问题2：什么类型的干细胞适合于 干细胞技术治疗？
问题1：干细胞治疗和干细胞 技术治疗糖尿病的区别
干细胞技术治疗糖尿病必须要 克服的技术难题
1. 干细胞的数量：5-10亿 2. 干细胞的分化效率：>70% 3. 干细胞分化后的功能: >30% 4. 安全性：无成瘤性和低免疫原性
18
A1
16
A2
14
A3
12
A4
10
8
6
4
2
0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 14 21 30 60 90
Days
IGTT
20
胰腺切除
15
肾包膜移植
正常
10
5
0 0
5 10 20 30 60 90 120 Time(min)
G ly c e m i a (m M
Glycemia(mM)
1 3 5 7 10 15 20 25 Time(Days)
胰岛移植治疗糖尿病的部位选择
1. 门静脉： 功能好，效果快，容易损伤， 安全性差，技术要求高
2. 肾包膜下： 功能较好，效果较快， 安全性较好，技术要求较高
3. 肌肉组织： 功能较差，效果慢， 安全性好，技术要求较低
肝组织内干细胞分化胰岛的 胰岛素和C-肽染色
100 50 0
0h 0.5h 2h 4h 12h 24h
胰岛样结构的免疫荧光染色
天然胰
干细胞胰
Islet
C-peptide
Glucagon
干细胞分化胰岛的移植
肾包膜下
门静脉
干细胞分化胰岛移植后的血糖变化
Glycemia(mM)
40 35 30 25 20 15 10
5 0
-3 -1 0
肝窦移植 肾包膜下移植
Nestin
PDX-1
Neurogenin3
胚胎胰腺干细胞胰岛素 mRNA的表达
Marker 10W 11W 16W 18W
β-actin Insulin
胰腺干细胞定向诱导分化方案
1. 分离：
胶原酶消化
胰腺组织
胰岛样结构
2. 体外扩增：
LIF/bFGF 胰岛样结构
体外扩增
3. 诱导分化：
胰岛干细胞
GLP-1 Activin A
15
N4
10
N5
5
0 0 1 2 3 4 5 6 7 10 15 21 28 35 42 49 56 63
Days
C-peptide
6
N1
5
N2
N3
4
N4
3
N5
2
1
百度文库
0 0 3 7 14 21 28 35 42 47 54 61 68 75 Days
IGTT
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
3. 抑制干细胞的分化： 无血清培养基 胎牛血清的选择 白血病抑制因子的应用
应用于糖尿病治疗的干细胞的评价
增殖性 胚胎干细胞 +++ 诱导型干细胞 + 成体干细胞 + 胚胎组织干细胞 ++
成熟度 +
+ - ++ ++
+++
成瘤性 +++ -
免疫原性 --++ -/+
问题4：如何提高人胚胎组织干细胞 的定向分化效率？
Laminin Collagen Ⅳ
Insulin(uU/ml) Insulin (uU/ml)
干细胞分化胰岛的胰岛素释放
350 300 5.6mM
20mM 250
200
150
100
50
0 stem cells
Islets
500 450 stem cells 400 Islets 350 300 250 200 150
0
Control Diabetes Stem cells
5 10 15 30 60 90 120 Minutes
No.1
No.2
肝内导管样结构的形成
Cytokaratin 19
移植到门静脉的干细胞胰岛的鉴定
胰岛素
No.1
C-肽
干细胞分化胰岛移植对肝脾的影响
干细胞移植的肝脏 正常肝脏
正常脾脏
干细胞移植后的脾脏
问题3：如何解决人胚胎组织干细胞 的体外扩增？
人胚胎胰岛的发育和分化规律
原始干细胞
内胚层干细胞
胰腺干细
胰腺
外分泌干细 外分泌腺
胰岛细胞
内分泌干细胞
α β δ pp 前体细胞
人胚胎胰腺发育过程中激素的表达
Glucagon
Insulin
PP
SS
10 weeks
14 weeks
人胚胎胰岛干细胞的鉴定
Marker β-actin nestin CD44 Thy1 CK18 CK19 PDX-1 Ngn3 Marker
胰岛内分泌细胞
胚胎胰腺干细胞的原代培养
1D
3D
5D
7D
问题5：如何提高干细胞分化细胞 的功能？
胰岛样结构的诱导形成
诱导前
诱导后
DTZ染色
干细胞分化胰岛的胰岛素mRNA表达
Marker 0w 1w 2w 2w岛 Insulin
胰腺干细胞分化胰岛的结构比较
天然胰岛
干细胞分化胰岛 Fibronectin
人胰岛的移植部位
胰岛素
C-肽
问题6：干细胞分化胰岛的移植部位 和安全性评价
干细胞分化胰岛治疗恒河猴糖尿病
血 糖 (mmol/L) 0天 1天 3天 5天 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 12周 13周 14周 15周 16周 17周 18周
干细胞胰岛移植治疗恒河猴糖尿病