以及谷胱甘肽转移酶
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谷胱甘肽S_转移酶综述页数:3
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二苯乙烯类 （stilbenes）
-2-
2
研究背景
二 相 代 谢 酶 的 表 达 依 赖 于 ARE 基 因 的激活，这个过程是通过激活核转 录 因 子 Nrf2 实 现 的 。 在 基 本 的 生 理 状态下，转录因子Nrf2与Keap1结合 存在于细胞质中并通过Keap1-Cul3Rbx依赖的泛素化过程保持平衡。在 氧化应激条件下，Nrf2可与Keap1解 离从而使其泛素化减少，从而更多 的 进 入 细 胞 核 ， 激 活 ARE 基 因 并 诱 导二相代谢酶的表达。
-9-
9
研究结果
5. 利用计算机分子对接，当Keap1的Cys434被谷胱甘肽化
修饰后，Keap1与Nrf2的相互作用显著减弱； Keap1和GSSG在体外孵
育反应，经过LC-MS分 析，有七个半胱氨酸残 基发生谷胱甘肽化修饰 Chem. Res. Toxicol. 2008, 21, 2051–2060.
-12-
12
结论与讨论
经典推测模型 细胞内表现？
迈克尔受体小分子 （Michael addition acceptors）
1、激活Keap1-Nrf2通路； 2、抑制NF-κB; 3、诱导凋亡； 4、细胞周期阻滞。
为何各类迈克尔受体小分子又 体现出不同的分子靶向性？
1、改变细胞内GSH的能力 和速率不同？ 2、残留靶向性？
图6 外源性GSH对PYDDT激活Keap1-Nrf2通路及诱导二相代谢酶的影响
-8-
8
研究结果
4. PYDDT所导致的细胞内GSH/GSSG比例的下降可引起 细胞内蛋白的广泛谷胱甘肽化，这其中也包括Keap1；
图7 “Thiol-disulfide exchange”理论
图8 PYDDT导致细胞内蛋白谷胱甘肽化修饰
图11 PYDDT的其它潜在分子靶点
11
结论与讨论
2. 传统上认为迈克尔受体小分子（包括异硫氰酸酯类、查尔酮 类、丹参酮类等）发挥活性作用的方式为直接与蛋白半胱氨酸 残基的巯基结合。虽然很多体外实验证明了该假设，但在细胞 内的情况目前尚无明确阐述。我们在一定的实验基础上提出一 种全新的假设：即该类化合物可能并非与蛋白质巯基结合而更 倾向于首先与细胞内GSH结合，这种GSH的迅速下调可导致蛋 白质的不同修饰（包括本研究中的谷胱甘肽化），从而发挥该 类化合物的生物活性；
PYDDT为一种从传统中药禹州漏芦 中分离得到的炔醇取代噻吩类化合 物 。 中 国 药 典 （ 2005 年 版 ） ： 漏 芦 具有清热解毒、排脓止血、消脓止 血的功效。
-3-来自百度文库
图1 Keap1-Nrf2通路示意图
图2 PYDDT的化学结构
3
材料与方法
结晶紫法确定IC50值 NQO1诱导测试法确定CD值 Western Blotting考察蛋白表达情况 LC-MS&NMR技术考察PYDDT与GSH结合情况 免疫荧光考察Nrf2入核及总蛋白谷胱甘肽化修饰情况 免疫沉淀考察Keap1谷胱甘肽化修饰情况 DTNB法测定细胞内GSH含量 流式细胞术测定细胞内ROS水平 分子对接模拟谷胱甘肽化修饰对蛋白相互作用的影响
二相代谢酶诱导剂属于一类癌症化 学预防剂，它通过升高具有清除自 由基和亲电试剂作用的二相代谢酶 保护细胞避免致癌作用。二相代谢 酶家族包括NAD(P)H: 醌氧化还原酶 （ NQO1 ） 、 单 加 氧 酶 （ OH-1 ） 以 及谷胱甘肽转移酶（GST）等。
卷心菜 红酒
异硫氰酸酯类 （isothiocyanates）
-13-
13
致谢
感谢浙江大学药学院药物信息学研 究所马忠俊老师及其课题组全体同学！
-14-
14
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15
强氢键干扰 图9 Keap1的Cys434残基被谷胱甘肽化修饰后对Keap1-Nrf2复合物的影响
-10-
10
结论与讨论
1. PYDDY为一类结构新颖的迈克尔受体小分子，在低细胞毒 浓度下即具有很强的二相代谢酶诱导作用，说明PYDDT可作 为一种有效的肿瘤化学预防剂进行更加深入的研究；
图10 PYDDT激活Keap1-Nrf2通路的可能机制 -11-
-4-
4
研究结果
1. PYDDT具有很强的二相代谢酶诱导作用，且该作用是通 过激活Keap1-Nrf2通路实现的；
图3 PYDDT激活Keap1-Nrf2通路并诱导二相代谢酶的表达
-5-
5
研究结果
2. PYDDT在体外实验中能够与GSH强烈结合，在细胞内可 在4小时内迅速降低细胞内GSH含量，并上调ROS水平；
二相代谢酶诱导剂PYDDT激活 Keap1-Nrf2通路的机制研究
浙江大学药学院 张潇雨, 马忠俊
报告人：张潇雨
Email: zhangxy_zju@hotmail.com
-1-
1
研究背景
肿瘤的发展过程包括起始期、促进 期和发展期，这一过程大概经历 10~40年的时间。《中国癌症预防与 控制规划纲要》（2004-2010）的指 导原则中第一条就明确指出，“癌 症防治必须坚持‘预防为主’”。 肿瘤的预防措施包括一级预防和二 级预防。一级预防是指消除致癌因 素的影响、采取能降低致癌风险的 生活方式；二级预防即化学预防， 系采用无毒的天然或合成物质，通 过逆转、阻断或延迟癌症发生的各 个阶段降低恶性肿瘤发生的危险。
图4 PYDDT在体外能够与GSH强烈结合
-6-
6
研究结果
2. PYDDT在体外实验中能够与GSH强烈结合，在细胞内可 在4小时内迅速降低细胞内GSH含量，并上调ROS水平；
23%
图5 PYDDT在细胞内可迅速降低细胞内GSH含量，并上调ROS水平
-7-
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研究结果
3. PYDDT激活Nrf2及Nrf2介导的NQO1表达均可被外源性 GSH逆转；
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研究背景
二 相 代 谢 酶 的 表 达 依 赖 于 ARE 基 因 的激活，这个过程是通过激活核转 录 因 子 Nrf2 实 现 的 。 在 基 本 的 生 理 状态下，转录因子Nrf2与Keap1结合 存在于细胞质中并通过Keap1-Cul3Rbx依赖的泛素化过程保持平衡。在 氧化应激条件下，Nrf2可与Keap1解 离从而使其泛素化减少，从而更多 的 进 入 细 胞 核 ， 激 活 ARE 基 因 并 诱 导二相代谢酶的表达。
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研究结果
5. 利用计算机分子对接，当Keap1的Cys434被谷胱甘肽化
修饰后，Keap1与Nrf2的相互作用显著减弱； Keap1和GSSG在体外孵
育反应，经过LC-MS分 析，有七个半胱氨酸残 基发生谷胱甘肽化修饰 Chem. Res. Toxicol. 2008, 21, 2051–2060.
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结论与讨论
经典推测模型 细胞内表现？
迈克尔受体小分子 （Michael addition acceptors）
1、激活Keap1-Nrf2通路； 2、抑制NF-κB; 3、诱导凋亡； 4、细胞周期阻滞。
为何各类迈克尔受体小分子又 体现出不同的分子靶向性？
1、改变细胞内GSH的能力 和速率不同？ 2、残留靶向性？
图6 外源性GSH对PYDDT激活Keap1-Nrf2通路及诱导二相代谢酶的影响
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研究结果
4. PYDDT所导致的细胞内GSH/GSSG比例的下降可引起 细胞内蛋白的广泛谷胱甘肽化，这其中也包括Keap1；
图7 “Thiol-disulfide exchange”理论
图8 PYDDT导致细胞内蛋白谷胱甘肽化修饰
图11 PYDDT的其它潜在分子靶点
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结论与讨论
2. 传统上认为迈克尔受体小分子（包括异硫氰酸酯类、查尔酮 类、丹参酮类等）发挥活性作用的方式为直接与蛋白半胱氨酸 残基的巯基结合。虽然很多体外实验证明了该假设，但在细胞 内的情况目前尚无明确阐述。我们在一定的实验基础上提出一 种全新的假设：即该类化合物可能并非与蛋白质巯基结合而更 倾向于首先与细胞内GSH结合，这种GSH的迅速下调可导致蛋 白质的不同修饰（包括本研究中的谷胱甘肽化），从而发挥该 类化合物的生物活性；
PYDDT为一种从传统中药禹州漏芦 中分离得到的炔醇取代噻吩类化合 物 。 中 国 药 典 （ 2005 年 版 ） ： 漏 芦 具有清热解毒、排脓止血、消脓止 血的功效。
-3-来自百度文库
图1 Keap1-Nrf2通路示意图
图2 PYDDT的化学结构
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材料与方法
结晶紫法确定IC50值 NQO1诱导测试法确定CD值 Western Blotting考察蛋白表达情况 LC-MS&NMR技术考察PYDDT与GSH结合情况 免疫荧光考察Nrf2入核及总蛋白谷胱甘肽化修饰情况 免疫沉淀考察Keap1谷胱甘肽化修饰情况 DTNB法测定细胞内GSH含量 流式细胞术测定细胞内ROS水平 分子对接模拟谷胱甘肽化修饰对蛋白相互作用的影响
二相代谢酶诱导剂属于一类癌症化 学预防剂，它通过升高具有清除自 由基和亲电试剂作用的二相代谢酶 保护细胞避免致癌作用。二相代谢 酶家族包括NAD(P)H: 醌氧化还原酶 （ NQO1 ） 、 单 加 氧 酶 （ OH-1 ） 以 及谷胱甘肽转移酶（GST）等。
卷心菜 红酒
异硫氰酸酯类 （isothiocyanates）
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致谢
感谢浙江大学药学院药物信息学研 究所马忠俊老师及其课题组全体同学！
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强氢键干扰 图9 Keap1的Cys434残基被谷胱甘肽化修饰后对Keap1-Nrf2复合物的影响
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结论与讨论
1. PYDDY为一类结构新颖的迈克尔受体小分子，在低细胞毒 浓度下即具有很强的二相代谢酶诱导作用，说明PYDDT可作 为一种有效的肿瘤化学预防剂进行更加深入的研究；
图10 PYDDT激活Keap1-Nrf2通路的可能机制 -11-
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1. PYDDT具有很强的二相代谢酶诱导作用，且该作用是通 过激活Keap1-Nrf2通路实现的；
图3 PYDDT激活Keap1-Nrf2通路并诱导二相代谢酶的表达
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研究结果
2. PYDDT在体外实验中能够与GSH强烈结合，在细胞内可 在4小时内迅速降低细胞内GSH含量，并上调ROS水平；
二相代谢酶诱导剂PYDDT激活 Keap1-Nrf2通路的机制研究
浙江大学药学院 张潇雨, 马忠俊
报告人：张潇雨
Email: zhangxy_zju@hotmail.com
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研究背景
肿瘤的发展过程包括起始期、促进 期和发展期，这一过程大概经历 10~40年的时间。《中国癌症预防与 控制规划纲要》（2004-2010）的指 导原则中第一条就明确指出，“癌 症防治必须坚持‘预防为主’”。 肿瘤的预防措施包括一级预防和二 级预防。一级预防是指消除致癌因 素的影响、采取能降低致癌风险的 生活方式；二级预防即化学预防， 系采用无毒的天然或合成物质，通 过逆转、阻断或延迟癌症发生的各 个阶段降低恶性肿瘤发生的危险。
图4 PYDDT在体外能够与GSH强烈结合
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研究结果
2. PYDDT在体外实验中能够与GSH强烈结合，在细胞内可 在4小时内迅速降低细胞内GSH含量，并上调ROS水平；
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图5 PYDDT在细胞内可迅速降低细胞内GSH含量，并上调ROS水平
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研究结果
3. PYDDT激活Nrf2及Nrf2介导的NQO1表达均可被外源性 GSH逆转；