生物技术药物质量控制

❖ 取兔离体动脉条剪成约1.5cm 长、2～3 mm 宽的螺旋环，悬挂于含10mL通氧的37℃台 氏液(取NaC1 8.0 g、KC1 0.2 g、CaCl 20.2g、NaH2PO40.05g、MgSO4·7H2O 0.1g、NaHCO3 1.0 g、Glucose 1.0g用蒸 馏水配成1 000 mL的溶液， 置于玻璃或塑料 瓶中，用1 mol·L-1 NaOH 溶液调pH 至7.4) 的麦氏浴槽中，加负荷1g，稳定1h，期间每 20min换1次台氏液： 连接多导记录仪，调 节灵敏度，记录血管的张力变化。
质量控制方源自文库学研究具体内容
一、生物学活性测定和比活性 二、蛋白质纯度检查 三、蛋白质含量测定 四、蛋白质药物理化性质的鉴定 五、蛋白质的二硫键分析 六、对糖蛋白的特殊要求 七、残余杂质检查 八、安全性及其他检测项目 九、生物技术药物待测样品保存
一、生物学活性测定和比活性
1、意义： 1）基因工程产品的化学本质为蛋白质、多肽， 其活性由产品的氨基酸序列或其空间结构所形成 的活性中心所决定的，与其绝对质量不一致。 2）基因工程产品的生物学活性与药效学基本相 一致。 3）利用生物学活性建立的测定效价体系，是给 药品定量的依据，保证产品药效的重要手段。
重组产品质量控制上存在的难点
❖ 建立重组药物的生物学活性测定方法； ❖ 理化测定标准品的稳定性； ❖ 人源化单抗中的人源化程度检测方法及标准研究； ❖ 重组人白蛋白等大剂量重组产品安全性评价问题； ❖ 反义核酸药物理化特性测定和效力测定，即如何评
价反义核酸的体内及体外活力； ❖ 基因治疗药物的安全性评价包括反转录病毒、生物
不适合
检出大量未增殖 检出未增
浮游细胞 细胞，处理时费力 殖活细胞
生物学活性测定分析方法
1、用能诱导50%最大反应的待测样品最高稀释 度作为参考效价（或滴度），或以此稀释度中所含 样品的量为1单位，即以此稀释度的倒数为待测样 品所含的单位数。
2、比较已知浓度或活性单位样品标准品和待测
样品的实验结果。
❖ 待张力曲线基线稳定后，加入1.25 mg·mL-1盐 酸去氧肾上腺素溶液0.05 mL于麦氏浴槽中使其 终浓度为6.25×10-5 mg·mL-1 ，曲线升高至最 高并稳定后，开始按累计浓度给药法(曲线稳定 后对倍增加样品浓度为：6.25×10-5～8.0×10-2 RU·mL )加入重组人脑利钠肽对照品，记录血管 的张力变化。完成上述给药后，洗脱并稳定1 h， 期问每20 min换1次台氏液。待基线稳定后， 按测定对照品的方法测定待测样品，记录测定结 果。计算对照品和各实验样品的半效稀释倍数， 按下式计算样品效价：样品效价=对照品效价× 样品半效稀释倍数／对照品半效稀释倍数
❖ 自1982年第一个基因重组药物—重组胰岛素上 市以来，全世界约有60余种重组产品开发成功， 包括基因工程药物、基因工程抗体，重组疫苗、 反义核苷酸药物、基因治疗药物、DNA疫苗。
❖ 我国在“七五”、“八五”、“九五”期间国 家“863”高技术项目支持下，先后建立一系列 基因重组制品质量标准和质控方法，共完成国 家一类、二类新药20余种产品的质量标准研究。
2、标准品的使用，最大限度地减少实验室之间 和各种影响测定因素地干扰。
二、蛋白质纯度检查
1、蛋白质纯度检查是重组蛋白质药物地重要指 标之一。 2、按WHO规定必须用HPLC和非还原SDSPAGE两种方法测定，其纯度都应达到95%以上， 有的甚至要求达到99%以上。 3、纯度的检查通常是在原液中进行。 4、方法：非还原SDS-PAGE电泳法、HPLC法、 毛细管电泳。
生物技术药物质量控制
李平生
概述
❖ 利用人体内的天然物质治疗人类的疾病或达到某 种医学效果一直是医学上的一个重要研究领域。
❖ 20世纪70年代以来产生了DNA重组技术，这种 新技术是现代生物技术的主体，近年来首先在医 药领域获得了飞速发展。生物技术的应用2/3用于 医药，生物技术新型药物和疫苗已有50多种产品 投放市场，400多种正在进行临床试验，2000多 种在临床前研究。
分子大小、离子交换 10～120min
几小时
10～30min
好 10～50ul ng ～ug
细胞培养法中细胞染色标记方法
3H-thymidine、BrdU 是反映DNA合成、增殖 细胞 数的比例的。BrdU：首先用BrdU做标记，固定细 胞，用核苷酸酶处理后使过氧化物酶结合抗BrdU抗 体发生反应。 MTT（四氮唑盐）：其在活细胞的线粒体中可以 定量地被琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶 物MTT formazan,二甲基亚砜（DMSO）和酸化的 异丙 醇或酸化的SDS均能溶解紫色结晶物，通过比色法 测 定MTT formazan的量可以反映线粒体电子传递系
1、目标产品的均一性 2、建立目标产品生物学活性或免疫学效价测定方法 3、研究建立目标产品的免疫学活性的测定方法及质
控标准 4、研究建立国家标准品或参考品 5、建立目标产品生产相关杂质的限量分析方法和标
准 6、制定出保证上述生物技术产品临床安全、有效、
与WHO标准相一致的质量控制标准和规范化的检定 方法
几种细胞培养测定方法比较
3H-thymidine
BrdU
MTT
Alamar Blue
靶向物
DNA合成系统
线粒体电子传递系统
检出细胞的状态
增殖
增殖、生存
检出法
放射活性
色素、荧光
色素
色素、荧光
抽出的必要性
+
+
+
-
其他试剂的必要性
+
++
+
-
成本（以MTT为1时） 60
80-100（试剂盒） 1
2
缺点
使用同位素
效价测定一般原则
1、国际通用方法； 2、测定结果须用国际或国家标准品
校 正，以国际单位表示。
生物学活性测定方法分类
1）体外细胞培养测定法
a、促进细胞生长作用（G-CSF:NFS-60） b、抑制细胞生长作用 (TNF:L929) c、间接保护细胞作用 (IFN:VISH;VSV) 2）离体动物器官测定法 采用家兔主动脉条测定重组脑利钠肽生物 活性。 3）体内测定法 4）生化酶促反应测定法 5）免疫学活性测定法
A
活性标准 待测样品 品
值
ab
稀释度
生物学测定基本模式图
蛋白质药物的比活性测定的意义
1、比活性：每毫克蛋白质的生物学活性单位。 2、蛋白质的空间结构不能常规测定，而它的改变 （如二硫键的错误配对）可影响蛋白质的生物学活 性，从而影响药效，比活性可以反映此种情况。 3、比活性可反映产品生产工艺的稳定情况，可比较 不同表达体系、不同生产厂家生产同一产品时的质 量情况。 4、比活性是重组蛋白质药物不同于化学药的一项重 要指标，也是进行成品分装的重要定量依据。
2、重组DNA药物包括： ❖ 寡核苷酸药物：反义核酸等； ❖ 基因药物：腺病毒-IL-2、腺相关病毒-凝
血Ⅸ因子；腺病毒- P53 ❖ 细胞治疗制剂：抗原致敏的人树突状细胞 ❖ DNA疫苗：治疗乙型肝炎、爱滋病的核
酸疫苗等。
我国生物技术药物质量标准研究现状
❖ 现代医药生物技术的发展以及人类基因组计划 的完成和遗传病基因的不断发现，对医药领域 产生了巨大影响。
毛细管电泳：简便、快速、灵敏度和分 辨率高；价格高、重现性差。
特性 分离机制
分析所需时间 分辨力 样品体积 灵敏度范围 定量准确性 分析方式
仪器价格 日常消耗 自动化 人力操作 制备级 收集样品
几种检定重组蛋白纯度方法的比较
HPLC
SDS-PAGE、IEF CE
极性、非极性分配， 电荷、等电点
电荷等
非还原SDS-PAGE电泳法：
1、银染加样量≥5ug （1～10ng）
2、考马斯亮蓝R-250
加样量≥10ug （100ng）
结 果：无明显杂蛋白带出现；目标蛋白 量应不低于总蛋白量的95%或98%。蛋 白质样品在荷质比均一。
HPLC法：分子筛、反相层析，离子交 换层析，尽量采用与SDS-PAGE原理不 同的反相或离子交换层析，不主张用分 子筛分析。
生物技术药物质量标准研究的依据
一、主要依照《重组DNA产品质量控制要 点》、《中国生物制品规程》、《中国药典》 等要求进行。 二、参考世界卫生组织（WHO）和美国FDA 颁布的指南、ICH文件和《欧洲药典》。
检定标准、检定方法：准确可靠、切实可行； 保证产品安全、有效。
生物技术药物质量标准研究的内容
Alamar Blue：氧化型Alamar Blue （600nm）可被活细胞中的线粒体酶还原，还 原后染料（570nm）发生颜色和荧光改变，颜 色和荧光的深浅与活细胞数成正比，可用分光光 度计或荧光检测仪检测。
Crystal violet：染活细胞后，在比色计中测 定光吸收值（A），A值与着染色细胞数成正比。
测定方法
规定标准
动物基础的生物活性测定
70%～130%标示量
细胞基础的生物活性测定
80%～120%标示量
体外酶法的生物活性测定
85%～115%标示量
受体结合的生物活性测定
85%～115%标示量
生物学活性效价测定过程中 标准品的作用
1、生物学活性测定变异范围大，同样制品在不 同实验室测定结果差异很大，必须有一个统一 的标准。
❖ 据报道，国外6500万人接受重组乙肝疫苗、100 万人接受t-PA治疗，超过50万人使用EPO，每天 约有1000万人接受重组人胰岛素的治疗。
❖ 生物技术产品的生产和管理按生物制品的 要求进行，不仅对最终产品的质量实施有 效控制，而且特别重视对生产工艺的全过 程进行质量控制,其中包括对每个生产步 骤的验证、质量检定（QC）、质量保证 部（QA）对生产和质量检定的全过程进 行严格的管理。
生物技术药物的质量控制
生物技术药物的特点： 1、来源：活的生物体（细菌或细胞）； 2、结构：复杂（包括组成、空间结构）； 3、生产：涉及生物材料和生物学过程（发
酵、细胞培养，分离纯化等）， 有其固有的易变性。
生物技术药物的质量控制
质量控制包括两个方面： 1、生产过程中质量控制GMP（硬件、软件） 2、最终目标产品的质量控制（方法学研究）
生物技术药物
1、概念： 采用DNA重组技术或其他新 生物技术生产的治疗和预防 药物。 重组DNA药物
2、分类 ｛ 重组蛋白质药物
1、重组蛋白质或重组多肽药物包括：
细胞因子类：rIFN、IL-2、EPO等； 抗细胞素治疗：CD4可溶性受体等； 重组溶血栓类：rSK、rSAK等； 人源化单克隆抗体制剂； 重组疫苗和菌苗制剂。
生物学活性测定方法选择
2、定量、半定量、定性方法
a、通过研究首先选择能够定量评价的方 法，最好的选择是背景较低的反应，并且对 相关产品有陡峭的、可重复的剂量-反应曲 线；其次考虑半定量方法（如NGF），最 后考虑定性（如BMP）方法。
b、对生产工艺稳定，生物学活性测定方 法复杂，可采用其他替代方法（如重组人生 长激素用HPLC定量方法代替复杂生物活性 测定方法）。
生物学活性测定方法选择
体内测定和体外测定方法
a、体内测定：即整体动物测定，能为较大范 围的重组产品的效价提供有用信息，但费时、 昂贵、难操作及同时存在伦理问题，大多数情 况下倾向于选择体外测定方法。
b、体外测定：可使用分离的器官或组织、 原代细胞或传代细胞系，目前最常用方法是连 续生长、因子依赖的、克隆化的细胞系的方法， 其测定结果比较准确、重现性好、经济、容易 使用和便于统计分析。
生物活性测定标准范围确定
1、使用验证过的测定和分析方法，并提供 用此方法的效价测定平均值和单测定一批误 差的可信限范围。 2、对于成品的生物活性测定标准，要根据 不同方法的特点规定相当标示量的范围，目 前，生物活性的测定方法有四类：动物基础、 细胞基础、生化（酶）法、特异（免疫、受 体）结合法。
不同生物活性测定方法的规定标准表
分布和效力测定； ❖ DNA疫苗的安全性和效力检测方法研究； ❖ 干细胞治疗产品的质量标准的建立（干细胞鉴定及
活力测定） 。
我国基因工程产品安全管理 法规和技术指南
《传代细胞系生产生物制品的规程》 《人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点》 《预防用新生物制品临床研究的技术要求》 《人用重组DNA制品质量控制要点》 《人的体细胞治疗申报临床试验指导原则》 《人基因治疗申报临床试验指导原则》 《药理毒理检查指导原则》 《药品生产质量管理办法》 《药品注册管理办法》