2.2柠檬酸(C6H8O7·H2O)含量的测定
2.2.1试制和溶液
2.2.1.1酚酞:按GB604-77《指示剂pH变色域测定法》配制。
2.2.1.2氢氧化钠(GB629-81):1N标准溶液,按GB601-77《化学试剂标准溶液制备方法》配制。
2.2.2测定手续
称取1.5g试样(称准至0.0002g),加40ml新煮沸的冷水,溶解。加3滴1％酚酞指示剂,用1N氢氧化钠标准溶液滴定至微红色。2.2.3计算
V×C×0.06404
X＝━━━━━━━━×100 (1)
m(1-0.08566)
式中:
X──一水柠檬酸含量(按无水计),%;
V─—滴定试样所耗氢氧化钠标准溶液的体积,mL;
C─—氢氧化钠标准溶液的浓度,mol／L;
m─—试样质量,g;
0.06404─—与1ml氢氧化钠溶液[CNaOH=1.000mol/L]相当的以克表示的柠檬酸的质量;
0.08566──C6H8.H2O中的H2O的理论含量,即18/210.14
实验四柠檬酸含量的测定 实验目的 1．掌握配制和标定NaOH标准溶液的方法。 2．进一步熟练滴定管的操作方法。 3．掌握柠檬酸含量测定的原理和方法。 主要试剂和仪器 仪器：4F滴定管；锥形瓶；容量瓶；移液管（25mL）；烧杯；洗瓶。 试剂：邻苯二甲酸氢钾（基准物质， 100-1250C干燥1小时，然后放入干燥器内冷却后备用）；NaOH固体；柠檬酸试样；0.2%酚酞乙醇溶液。 实验原理 大多数有机酸是固体弱酸，如果有机酸能
溶于水，且解离常数Ka ≥10-7，可称取一定量的试样，溶于水后用NaOH 标准溶液滴定，滴定突跃在弱碱性范围内，常选用酚酞为指示剂，滴定至溶液由无色变为微红色即为终点。根据NaOH 标准溶液的浓度c 和滴定时所消耗的体积V 及称取有机酸的质量，计算有机酸的含量。 n n 1(H A)(H A)100%1000c V M n m ω??=??样 有机酸试样通常有柠檬酸，草酸, 酒石酸, 乙酰水杨酸, 苯甲酸等。滴定产物是强碱弱酸盐,滴定突跃在碱性范围内,可选用酚酞为指示剂。用NaOH 标准溶液滴定至溶液呈粉红色(30s 不褪色)为终点。 实验步骤 1．0.10 mol ·L -1 NaOH 溶液的配制及标定 0.10 mol ·L -1 NaOH 溶液的配制同实验一。 准确称取0.4-0.6 g 邻苯二甲酸氢钾，置
于250 mL 锥形瓶中，加入20-30 mL水，微热使其完全溶解。待溶液冷却后，加入2-3 滴0.2%酚酞指示剂，用待标定的NaOH溶液滴定至溶液呈微红色，半分钟内不褪色，即为终点（如果较长时间微红色慢慢褪去，是由于溶液吸收了空气中的二氧化碳所致），记录所消耗NaOH溶液的体积。平行测定3次。 2.柠檬酸试样含量的测定 用分析天平采用差减法准确称取柠檬酸试样约1.5g，置于小烧杯中，加入适量水溶解，定量转入250mL容量瓶中，用水稀至刻度，摇匀。 用25mL移液管移取上述试液于250mL锥形瓶中，加入酚酞指示剂1～2滴，用NaOH标准溶液滴至溶液呈微红色，保持30秒不褪色，即为终点。记下所消耗NaOH溶液体积，计算柠檬酸质量分数。如此平行测定3次，相关数
货号：QS2107-25 规格：25管/24样线粒体柠檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量 试剂盒说明书 分光光度法 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： CA是线粒体三羧酸循环的第一个中间产物，由柠檬酸合酶催化乙酰CoA与草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循环强度的主要指标之一。 配合测定丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性、乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和CA含量，其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脱氢酶活性变化可以反映糖酵解进行程度，（2）综合分析丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性和乙酰CoA含量变化可以反映脂肪酸β-氧化途径提供的乙酰CoA 情况，（3）乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和CA含量变化可以反映三羧酸循环进行状况。 测定原理： CA在柠檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性条件下，α-酮酸进一步与苯肼反应，生成相应的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在330nm处有吸收峰，该波长下吸光度的变化程度可反映出CA的含量。 自备实验用品及仪器： 分光光度计、水浴锅、可调式移液枪、1mL石英比色皿、研钵和蒸馏水。 试剂组成和配制： 酸性提取液：液体25mL×1瓶，4℃保存。 碱性提取液：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体7.5mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体2.5mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入7.5mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存； 标准品：液体1mL×1支，10μmol/mL柠檬酸标准液，4℃保存。 线粒体中柠檬酸提取： 称0.05~0.1g样品（建议称0.1g样本），加入0.5mL酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃离心5min；取上清至另一EP管中，11000g/min 4℃离心10min，弃上清（取300μL该上清液和300μL碱性提取液中和后可用于细胞质CA含量测定）；沉淀即线粒体，向沉淀中加入0.5mL酸性提取液，充分悬浮溶解，超声波破碎（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），取此溶液300μL和300μL碱性提取液中和，混匀，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。 测定步骤： 1、分光光度计预热30 min以上，调节波长到330nm，蒸馏水调零。 2、试剂一、二和三37℃预热10min。 3、样本测定： 空白管和标准管通常只需要各做一个。 第1页，共2页
ODS为反相柱，流动相一般为甲醇、乙腈、水，等极性相对较大的物质，不可以用非极性物质做流动相，梯度洗脱时应从大水相开始，最后过渡到大有机相，实验结束后应用甲醇水或乙腈水冲洗，30-60min，如果实验中用到缓冲盐应用大水相冲洗60min以上，将盐替换出来，最后保存在85-95%的有机相中。 另外，色谱柱使用过程中不能碰撞、弯曲或强烈震动。 当柱子和色谱仪连结时，阀件或管路一定要清洗干净。 大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2 ～7.5，硅胶柱pH8时会发生硅胶溶脱，键合型柱p H<2时会发生键合相断裂，流动相尽量不超过色谱柱的p H范围。普通C18柱尽量避免在4 0℃以上的温度下分析。保护柱：最好使用预柱作为保护柱，减少污染物对分析柱的损伤。压力升高通常是需要更换预柱的信号。 安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙 反相柱（reversed phase column）：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。在反相柱中C18（Octadecylsilyl，简称ODS），即十八烷基硅烷键合硅胶填料，这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了CH、C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶（20～40μm）。 色谱柱的分类 1.根据所有的担体材料分为三种： (1)硅胶型：机械强度高，易制成小颗粒，理论塔板数高。 (2)聚合物型：在广泛的PH值范围内稳定。 (3)羟基磷灰石型：对蛋白质等生物高分子样品有特殊的选择性。 2.根据分离方式分为： (1)正相：SIL--磷脂、NH--糖、维生素E，CN--甾类激素。 (2)反相：ODS(C18)、(C8 CN TMS Pheny1)低分子量化合物。 (3)离子交换等。
实验四 柠檬酸含量的测定 实验目的 1．掌握配制和标定NaOH 标准溶液的方法。 2．进一步熟练滴定管的操作方法。 3．掌握柠檬酸含量测定的原理和方法。 主要试剂和仪器 仪器：4F 滴定管；锥形瓶；容量瓶；移液管（25mL ）；烧杯；洗瓶。 试剂：邻苯二甲酸氢钾（基准物质，100-1250C 干燥1小时，然后放入干燥器内冷却后备用）；NaOH 固体；柠檬酸试样；%酚酞乙醇溶液。 实验原理 大多数有机酸是固体弱酸，如果有机酸能溶于水，且解离常数Ka ≥10-7，可称取一定量的试样，溶于水后用NaOH 标准溶液滴定，滴定突跃在弱碱性范围内，常选用酚酞为指示剂，滴定至溶液由无色变为微红色即为终点。根据NaOH 标准溶液的浓度c 和滴定时所消耗的体积V 及称取有机酸的质量，计算有机酸的含量。 n n 1 (H A) (H A)100% 1000 c V M n m ω??=??样 有机酸试样通常有柠檬酸，草酸, 酒石酸, 乙酰水杨酸, 苯甲酸等。滴定产物是强碱弱酸盐,滴定突跃在碱性范围内,可选用酚酞为指示剂。用NaOH 标准溶液滴定至溶液呈粉红色(30s 不褪色)为终点。 实验步骤 1． mol ·L -1 NaOH 溶液的配制及标定
mol·L-1 NaOH溶液的配制同实验一。 准确称取 g邻苯二甲酸氢钾，置于250 mL 锥形瓶中，加入20-30 mL水，微热使其完全溶解。待溶液冷却后，加入2-3 滴%酚酞指示剂，用待标定的NaOH 溶液滴定至溶液呈微红色，半分钟内不褪色，即为终点（如果较长时间微红色慢慢褪去，是由于溶液吸收了空气中的二氧化碳所致），记录所消耗NaOH溶液的体积。平行测定3次。 2.柠檬酸试样含量的测定 用分析天平采用差减法准确称取柠檬酸试样约，置于小烧杯中，加入适量水溶解，定量转入250mL容量瓶中，用水稀至刻度，摇匀。 用25mL移液管移取上述试液于250mL锥形瓶中，加入酚酞指示剂1～2滴，用NaOH标准溶液滴至溶液呈微红色，保持30秒不褪色，即为终点。记下所消耗NaOH溶液体积，计算柠檬酸质量分数。如此平行测定3次，相关数据填入表2中。 实验数据记录及处理 写出有关公式，将实验数据和计算结果填入表1和2。根据记录的实验数据分别计算出NaOH溶液的准确浓度和柠檬酸的质量分数，并计算三次测定结果的相对标准偏差。对标定结果要求相对标准偏差小于%，对测定结果要求相对标准偏差小于%。 表1 邻苯二甲酸氢钾标定氢氧化钠
货号：MS2101 规格：100管/96样柠檬酸（citric acid, CA）含量测定试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： CA是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA是三羧酸循环第一步反应的产物。 测定原理： 酸性条件下，柠檬酸还原Cr6+生成Cr3+，在545nm处有特征吸收峰；通过测定545nm吸光值的增加，即可计算出样品中柠檬酸含量。 自备实验用品及仪器： 低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。 试剂组成和配置： 试剂一：液体×2瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体×1管，－20℃保存。 试剂四：粉剂×1管，室温保存。临用前配制，加入2mL试剂一，充分溶解。 试剂五：液体×1管，4℃避光保存。 标准品：液体×1管，250μmol/L柠檬酸标准液，4℃保存。 样品中柠檬酸提取： 1.液体样品中柠檬酸提取：取0.1mL液体加试剂一0.9mL，充分混匀，11000g，4℃离心10min， 取上清液，待测。 2.组织中柠檬酸提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约 0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。11000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 3.线粒体中柠檬酸提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取 约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，600g/min，4℃离心5min；取上清至另一EP管中，11000g，4℃离心10min，弃上清（此上清液可用于细胞质CA含量测定）；向沉淀中加试剂二200μl，以及试剂三2μl，充分悬浮溶解，11000g，4℃离心10min，取上清液，待测。 4.细菌、真菌中：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议 500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；11000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 测定操作： 1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到545 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一置于30℃水浴中预热30min。 3. 空白管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL蒸馏水，140μL试剂一，20μL试剂四，20μL 试剂五，混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A空白管。 第1页，共3页
柠檬酸的检测 2试验方法本试验所用水均为蒸馏水或离子交换水。 2.1鉴别试验 2.1.1试剂和溶液 2.1.1.1硫酸(GB625); 2.1.1.2硫酸汞:称取5g黄色氧化汞(HG3-1069),先加40ml水,然后缓缓加入20ml硫酸,边加边搅拌,再加40ml水搅拌使其溶解; 2.1.1.3高锰酸钾(GB643):0.1N溶液; 2.1.1.4氢氧化钠(GB629):4.3%(W/V)溶液; 2.1.1.5乙酸酐(GB677); 2.1.1.6吡啶(GB689); 2.1.1.7试样溶液:每毫升含柠檬酸5mg。 2.1.2试验步骤 2.1.2.1取少量试样,用直火炽灼,即缓缓分解,但不发生焦糖臭。 2.1.2.2取试样溶液2ml,用4.3%氢氧化钠溶液调至中性,加入1滴稀硫酸,加热至沸。加1滴0.1N 高锰酸钾溶液,振摇,紫色即消退。再加入1滴硫酸汞溶液,产生白色沉淀。 2.1.2.3取试样5mg,加入吡啶—醋酐(3:1)约5ml,即生成黄色到红色或紫红色的溶液。 2.2含量 2.2.1试剂和溶液 2.2.1.1氢氧化钠标准溶液(GB629):1N溶液,按GB601《标准溶液制备方法》配制和标定; 2.2.1.2酚酞(HGB3039):1%(W/V)溶液,按GB603《制剂及制品制备方法》配制。 2.2.2试验步骤称取1.5g试样(称准至0.0002g),加入50ml中性蒸馏水溶解,加3滴1%酚酞指示液,用1N氢氧化钠标准溶液滴定至粉红色为终点。 2.2.3计算 V·C×0.06404 X1＝————————×100 (1) m(1-0.08566) V·C×0.06404 X2＝———————-×100 (2) m 式中:X1-一水柠檬酸含量(按无水计),%; X2-无水柠檬酸含量,%; V-滴定试样所耗氢氧化钠标准溶液的体积,ml; C-氢氧化钠标准溶液的浓度,mol/L; m-试样质量,g; 0.06404-与1ml氢氧化钠标准溶液[CNaOH=1.000mol/L]相当的以克表示的柠檬酸的质量; 0.08566—C6H8O7.H2O中的H2O的理论含量,即18/210.14=0.08566。 2.3澄清度 2.3.1试剂和溶液 2.3.1.1硝酸(GB628):2M溶液;
货号: QS2101 规格：50管/48样柠檬酸（citric acid, CA）含量测定试剂盒说明书 可见分光光度法 注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： CA是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA是三羧酸循环第一步反应的产物。 测定原理： 酸性条件下，柠檬酸还原Cr6+生成Cr3+，在545nm处有特征吸收峰；通过测定545nm吸光值的增加，即可计算出样品中柠檬酸含量。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体×1支，－20℃保存。 试剂四：粉剂×1瓶，室温保存。临用前配制，加入5mL试剂一，充分溶解。 试剂五：液体×1瓶，4℃避光保存。 标准品：液体×1支，250μmol/L柠檬酸标准液，4℃保存。 样品处理： 1.液体样品：取0.1mL液体加试剂一0.9mL，充分混匀，11000g，4℃离心10min，取上清液 待测。 2.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。11000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 3.线粒体：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织， 加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，600g/min，4℃离心5min；取上清至另一EP管中，11000g，4℃离心10min，弃上清（此上清液可用于细胞质CA含量测定）；向沉淀中加试剂二200μl，以及试剂三2μl，充分悬浮溶解，11000g，4℃离心10min，取上清液待测。 4.细菌、真菌中：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议 500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；11000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 测定操作： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到545 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一置于30℃水浴中预热30min。 3. 空白管：取EP管，依次加入100μL蒸馏水，700μL试剂一，100μL试剂四，100μL试剂五，混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A空白管。 4. 标准管：取EP管，依次加入100μL标准液，700μL试剂一，100μL试剂四，100μL试剂五，混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A标准管。 5. 测定管：取EP管，依次加入100μL上清液，700μL试剂一，100μL试剂四，100μL试 第1页，共2页
柠檬酸（citric acid,CA）含量测定试剂盒使用说明产品简介： CA又称枸橼酸，广泛存在于各种生物胞质中，是生物体内重要的有机酸。CA也存在于线粒体基质中，是三羧酸循环第一步反应的产物，与脂肪、蛋白质和糖最终转化为二氧化碳密切相关。酸性条件下，柠檬酸可将Cr6+还原成Cr3+，在545nm处有特征吸收峰；通过测定545nm吸光值的增加，即可计算出样品中柠檬酸含量。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、低温离心机、掌上离心机、可调式移液枪、1ml玻璃比色皿、双蒸水。 产品内容： 试剂一×1瓶，100ml，4℃保存； 试剂二×1瓶，10ml，4℃保存； 试剂三×1支，0.1ml，-20℃保存； 试剂四×2，临用前配制，每支充分溶解于2.5ml试剂一； 试剂五×1瓶，5ml，4℃避光保存； 标准品×1支，临用前将标准品加1ml双蒸水溶解，取出50μl再加双蒸水950μl稀释，即为50μg/ml的标准液。 操作步骤： 一、柠檬酸提取： 1、液体样品中柠檬酸提取：取0.1ml液体加试剂一0.9ml，充分混匀，11000g/min4℃离心10min，取上清待测。 2、组织中柠檬酸提取：称约0.1g组织，加入1ml试剂一，冰上充分研磨，11000g/min 4℃离心10min，取上清待测。
3、线粒体中柠檬酸提取：称约0.1g组织，加入1ml试剂一，冰上充分研磨，600g/min，4℃离心5min，取上清至另一EP管中，11000g/min，4℃离心10min，弃上清，向沉淀中加试剂二200μl，以及试剂三2μl，充分溶解，待测。 二、测定操作表： 按下表操作： 空白管标准管测定管 双蒸水（ml）0.1// 50μg/ml标准液（ml）/0.1/ 提取液（ml）//0.1 试剂一（ml）0.70.70.7 试剂四（ml）0.10.10.1 试剂五（ml）0.10.10.1充分混匀，掌上离心机离心30s左右，然后室温静置30min，空白管调零，于545nm处测定吸光值，20min内完成测定。 柠檬酸含量计算： 1、按液体样品的体积计算（如血液中柠檬酸含量）： 柠檬酸含量（μg/ml）=50（μg/ml）×OD测定管/OD标准管×稀释倍数 2、按鲜重计算（组织柠檬酸含量）： 柠檬酸含量（μg/g FW）=50（μg/ml）×OD测定管/OD标准管÷鲜重（g/ml） 3、按蛋白含量计算 柠檬酸含量（μg/mg prot）=50（μg/ml）×OD测定管/OD标准管÷蛋白含量（mg/ml）注意事项： （1）样品处理等过程均需要在冰上进行；
综合性、设计性实验报告 (本科学生) 姓名：毛修林学号：2010021141 专业：化学班级：1班 实验课程名称：《分析化学实验》 指导教师及职称：郭红老师（高级实验师） 开课学期：2011 至2012 学年上学期 上课时间：2011 年12 月 6 日 资源环境学院编印
一、实验设计方案： 实验序号及名称：柠檬中总酸度的测定实验时间：2011年12月6日 小组合作：是小组号：一成员：毛修林、鲁静宁、杨全、 李丽霞 (一)．【实验目的】： 1.学会水果样品的预处理方法。 2.掌握酸碱滴定法测定水果样品中总酸度的原理和方法。 3.掌握强碱滴定弱酸的滴定过程，突跃范围及指示剂的选择原理。 4.柠檬总酸含量的测定。 5.规范记录数据并进行数据处理。 （二）．【主要试剂和仪器】： 1.试剂：KHP基准试剂，固体NaOH，酚酞指示剂，新 鲜柠檬2个。 2.仪器：榨汁机，50.00mL碱式滴定管，25 .00mL移液 管,250 mL锥形瓶3只，电子天平，250 mL容量瓶2只。
(三）．【实验原理】： 柠檬主要含有柠檬酸，其结构式为： ，各级解离常数分别为：K a1=7.4×10-4，K a2=1.7×10-5，K a3=4.0×10-7。由于柠檬酸各相邻解离常数之间相差不大，故不能分步滴定，但由于最后一级解离常数并不小，因此可以用NaOH标准溶液作滴定剂，按多元酸一次进行滴定。反应式为：HOOCCH2C(OH)(COOH)CH2COOH+3NaOH＝NaOOCCH2C(OH)(COONa)CH2COONa+3H2O。反应产物为弱酸弱碱盐，滴定范围在碱性范围内，因此可选用酚酞作指示剂，滴定至溶液由无色变为微红色即达到终点，再根据消耗NaOH标准溶液的体积计算柠檬总酸含量。 计算式为：总算度（g/100g）=(K(CV)NaOH×100)/(V试液×m试样/250)（其中：K=0.064）。
柠檬酸三钠测定—中和滴定法 应用范围： 供试品置锥形瓶中，加冰醋酸振摇溶解后，加醋酐与结晶紫指示液，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定至溶液显蓝绿色。读出高氯酸滴定液使用量，计算枸橼酸钠的含量。方法原理： 供试品置锥形瓶中，加冰醋酸振摇溶解后，加醋酐与结晶紫指示液，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定至溶液显蓝绿色。读出高氯酸滴定液使用量，计算枸橼酸钠的含量。试剂： 1.水（新沸放置至室温） 2.高氯酸滴定液（0.1mol/L） 3.结晶紫指示液 4.无水冰醋酸 5.醋酐6基准邻苯二甲酸氢钾 试样制备： 1.高氯酸滴定液（0.1mol/L） 配制：取无水冰醋酸（按含水量计算，每1g水加醋酐5.22mL)750mL，加入高氯酸（70%-72%）8.5mL，摇匀，在室温下缓缓滴加醋酐23mL，边加边摇，加完后再振摇均匀，放冷，加无水冰醋酸适量使成1000mL，摇匀，放置24小时。若所测供试品易乙酰化，则须用水份测定法测定本页的含水量，再用水和醋酐调节至本液的含水量为0.01%-0.2%。 标定：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.16g，精密称定，加无水 冰醋酸20mL使溶解，加结晶紫指示液1滴，用本液缓缓滴定至蓝色，并将滴定的结果 用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度，即可。 贮藏：置棕色玻璃瓶中，密闭保存。 2.结晶紫指示液 取结晶紫0.5g，加冰醋酸100mL使溶解，即得。 操作步骤： 精密称取供试品约80mg，置锥形瓶中，加冰醋酸5mL加热溶解后，放冷，加醋酐 10mL与结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定至溶液显蓝绿色，并将滴定结果用空白试验校正。记录消耗高氯酸滴定液的体积数（mL），每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于8.602mg的C6H5Na3O7。 注1：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一,“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。 参考文献： 中华人民共和国药典，国家药典委员会编，化学工业出版社，2005年版，二部，p.382。
柠檬酸（CA）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC2150 规格：50T/48S 产品内容： 试剂一：液体90mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体10mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体0.1mL×1支，－20℃保存。 试剂四：粉剂×1瓶，室温保存。临用前配制，加入5mL试剂一，充分溶解。 试剂五：液体5mL×1瓶，4℃避光保存。 标准品：液体1mL×1支，1mmol/L柠檬酸标准液，4℃保存；临用前稀释成250μmol/L柠檬酸标准液。产品说明： CA是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA是三羧酸循环第一步反应的产物。 酸性条件下，柠檬酸还原Cr6+生成Cr3+，在545nm处有特征吸收峰；通过测定545nm吸光值的增加，即可计算出样品中柠檬酸含量。 自备仪器和用品： 可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL比色皿和蒸馏水。 操作步骤： 一、样品中柠檬酸提取： 1.液体样品中柠檬酸提取：取0.1mL液体加试剂一0.9mL，充分混匀，11000g/min4℃离心10min，取上 清液，待测。 2.组织中柠檬酸提取：称约0.1g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，11000g/min4℃离心10min， 取上清液，待测。 第1页共3页
3.线粒体中柠檬酸提取：称约0.1g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，600g/min，4℃离心5min； 取上清至另一EP管中，11000g/min，4℃离心10min，弃上清（此上清液可用于细胞质CA含量测定）； 向沉淀中加试剂二200μL，以及试剂三2μL，充分悬浮溶解，11000g/min，4℃离心10min，取上清液，待测。 二、测定： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到545nm，蒸馏水调零。 2.试剂一置于30℃水浴中预热30min以上。 3.按下表在1.5mLEP管中加入相应试剂 试剂名称（μL）空白管测定管标准管 蒸馏水100 上清液100 标准品100 试剂一700 试剂四100 试剂五100 充分混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A空白管，A测定管，A标准管。 三、柠檬酸含量计算： 1.按液体样品的体积计算： 柠檬酸含量（mmol/L）=[C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×样品稀释倍数=2.5×(A 测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) C标准液：250μmol/L=0.25m mol/L；样品稀释倍数：（0.1mL样品+0.9mL试剂一）÷0.1mL样品=10。 2.按组织鲜重计算： 柠檬酸含量（μmol/g FW）=[C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V总÷W =0.25×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)÷W C标准液：250μmol/L；V总：上清液总体积，1.0mL=0.001L；W：样品质量，g。 3.按线粒体蛋白含量计算： 第2页共3页
实验四柠檬酸含量的 测定
精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢2 实验四 柠檬酸含量的测定 实验目的 1．掌握配制和标定NaOH 标准溶液的方法。 2．进一步熟练滴定管的操作方法。 3．掌握柠檬酸含量测定的原理和方法。 主要试剂和仪器 仪器：4F 滴定管；锥形瓶；容量瓶；移液管（25mL ）；烧杯；洗瓶。 试剂：邻苯二甲酸氢钾（基准物质，100-1250C 干燥1小时，然后放入干燥器内冷却后备用）；NaOH 固体；柠檬酸试样；0.2%酚酞乙醇溶液。 实验原理 大多数有机酸是固体弱酸，如果有机酸能溶于水，且解离常数Ka ≥10-7，可称取一定量的试样，溶于水后用NaOH 标准溶液滴定，滴定突跃在弱碱性范围内，常选用酚酞为指示剂，滴定至溶液由无色变为微红色即为终点。根据NaOH 标准溶液的浓度c 和滴定时所消耗的体积V 及称取有机酸的质量，计算有机酸的含量。 n n 1(H A)(H A)100%1000c V M n m ω??=??样 有机酸试样通常有柠檬酸，草酸, 酒石酸, 乙酰水杨酸, 苯甲酸等。滴定产物是强碱弱酸盐,滴定突跃在碱性范围内,可选用酚酞为指示剂。用NaOH 标准溶液滴定至溶液呈粉红色(30s 不褪色)为终点。 实验步骤 1．0.10 mol ·L -1 NaOH 溶液的配制及标定 0.10 mol ·L -1 NaOH 溶液的配制同实验一。 准确称取0.4-0.6 g 邻苯二甲酸氢钾，置于250 mL 锥形瓶中，加入20-30 mL 水，微热使其完全溶解。待溶液冷却后，加入2-3 滴0.2%酚酞指示剂，用待标定的NaOH 溶液滴定至溶液呈微红色，半分钟内不褪色，即为终点（如果较长时间微红色慢慢褪去，是由于溶液吸收了空气中的二氧化碳所致），记录所消耗NaOH 溶液的体积。平行测定3次。
生物仪器分析课程实验报告 姓名： 开课时间：2016－2017学年第 2学期授课教师：
一、实验目的 1、了解液相色谱仪的基本原理、结构及使用注意事项。 2、掌握液相色谱的操作方法。 二、实验原理 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,简称HPLC）又叫做高压或高速液相色谱，是色谱法的一个重要分支。它是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 果汁中含有多种有机酸，苹果酸和柠檬酸是果汁中重要的有机酸。样品经离心及过滤后，直接注入反相液相色谱体系，以磷酸二氢铵为流动相，经分离后采用紫外检测器在210nm处外标法定量分析。 三、实验简要步骤（最好以流程图形式表达） 1、标准溶液的配制：分别准确称取100mg苹果酸及柠檬酸标准标准品并用超纯水定容至100mL，配制成1000mg/L的贮备液。然后分别吸取上述溶液2mL、4mL、8mL、10mL定容到10mL（相当于浓度200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L），配制标准品混合溶液； 2、样品的处理：将样品经0.45μm水相微孔滤膜过滤后备用； 3、流动相的配制及过膜：0.05mol/L磷酸二氢铵溶液（磷酸调节至pH=2.5）配制，并过膜，脱气； 4、高相液相色谱仪操作流程： 1）开机顺序：
点击电脑图标，听到哔哔两声则说明仪器和LCsolution工作站已连接上。（关机顺序完全相反） 2）柱平衡 排气（Purge）：使用前按A泵、B泵和进样器的Purge键进行自动排气排杂。
中华人民共和国国家标准 食品添加剂柠檬酸GB 1987-86 Food additive Citric acid 代替GB 1987-80 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━本标准适用于淀粉、糖质原料发酵而制得的柠檬酸，在食品加工中用作酸味剂。 化学名称：2-羟基-1,2,3-丙三羧酸。 分子式:C6H8O7·H2O CH2 —COOH ｜ 结构式: HO—C—COOH·H2O ｜ CH2 —COOH 1 技术要求 1.1 感官要求:无色半透明结晶,或白色颗粒,或白色结晶粉末。 1.2 理化要求:见下表。 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━指标名称┃指标 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━ 柠檬酸(以C6H8O7·H2O计),％≥┃99.5 硫酸盐(以SO4--计),％≤┃0.03 草酸盐(以C2SO4--计),％≤┃0.05 钙盐┃符合规定 钡盐┃符合规定 重金属(以Pb计),％≤┃0.0005 氯化物(以Cl-计),％≤┃0.01 铁(Fe),％≤┃0.001 砷(As),％≤┃0.0001 硫酸灰分,％≤┃0.1 易炭化物┃不深于标准 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━ 2 试验方法 2.1 鉴别 2.1.1 试剂和溶液 2.1.1.1 硫酸(GB 625-77)。 2.1.1.2 硫酸汞:称取5g黄色氧化汞(HG 3-1069-77),加40ml水后,缓慢加入20ml硫酸, 边加边搅拌,再加40ml水搅拌使之溶解。 2.1.1.3 高锰酸钾(GB 643-77):0.1N溶液。 2.1.1.4 氯化钙7.5％(W/V)溶液。 2.1.1.5 乙酸(GB 676-78)。
-总酸的测定（滴定法）- 一、原理 果汁具有酸性反应，这些反应取决于游离态的酸以及酸式盐存在的数量。总酸度包括未解离酸的浓度和已解离酸的浓度。酸的浓度以摩尔浓度表示时，称为总酸度。含量用滴定法测定。果蔬中含有各种有机酸，主要有苹果酸、柠檬酸、酒石酸、草酸……。果蔬种类不同，含有机酸的种类和数量也不同，食品中酸的测定是根据酸碱中和的原理，即用标定的氢氧化钠溶液进行滴定。 二、材料、仪器与试剂 （一）材料：桃、杏、苹果、蔬菜等 （二）仪器：碱式滴定管（20ml）、容量瓶（100ml）、移液管（10ml）、烧杯（100ml）、研钵或组织捣碎机、天平、漏斗、滤纸等。 （三）试剂 1．L氢氧化钠：称氢氧化钠定容至1000ml，然后用L邻苯二甲酸氢钾标定，若浓度太高可酌情稀释。 2．1%酚酞指示剂：称酚酞，加入100ml 50%的乙醇溶解。 三、操作步骤 准确称取混合均匀磨碎的样品（或吸样品液），转移到100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度、摇匀。用滤纸过滤，准确吸取滤液20ml放入100ml三角瓶中，加入1%酚酞2滴，用标定的氢氧化钠滴定至初显粉色在内不褪色为终点，记下氢氧化钠用量，重复三次，取平均值。 四、计算 V C×N×折算系数 总酸度（%）=——×————————×100 W V1 式中：V——样品稀释总体积（ml） V1——滴定时取样液体积 C——消耗氢氧化钠标准液毫升数 N——氢氧化钠标准液摩尔浓度 W——样品重量（g） 折算系数：即不同有机酸的毫摩尔质量（g/mmol），食品中的总酸度往往根据所含酸的不同，而取其中一种主要有机酸计量。食品中常见的有机酸以及其毫摩尔质量折算系数加下： 苹果酸——（苹果、梨、桃、杏、李子、番茄、莴苣） 醋酸——（蔬菜罐头） 酒石酸——（葡萄） 柠檬酸——（柑橘类） 乳酸——（鱼、肉罐头、牛奶）
雪碧中柠檬酸含量的测定 XX 学院 化学化工学院 2010级化学1班 XX 指导老师 xx 摘要：柠檬酸作为一种食品添加剂，经常出现在我们的日常生活中，特别是在各类碳酸饮料中广泛使用。日前有媒体报道，杭州一消费者把12罐包装完好的雪碧存放3个月后竟都变成了空罐，不禁让很多人担心雪碧中柠檬酸会“腐蚀”人体。本次实验主要探究雪碧中柠檬酸含量，以检测其是否对人产生危害。 关键词： 柠檬酸 雪碧 含量 1实验原理 雪碧主要包括：水，果葡萄浆，白砂糖，食品添加剂（二氧化碳，柠檬酸，柠檬酸钠，苯甲酸钠），食用香精。 其中主要的酸性物质主要为碳酸和柠檬酸，在测定时将碳酸先逸出后再测定柠檬酸。 柠檬酸是一种重要的有机酸，摩尔质量为92.14g/mol ，又名枸橼酸，无色晶体，常含一分子结晶水，无臭，有很强的酸味，易溶于水。柠檬酸的分解温度为175℃。用碱标准溶液滴定试样液中的柠檬酸时，以酚酞为指示剂。当滴定至终点溶液呈浅红色，且30s 不褪色时，根据滴定时消耗的标准NaOH 溶液积,可算出试样中柠檬酸的总酸度。反应式为： 标定柠檬酸所用到的NaOH 标准液是采用间接法配制而成,并不是0.1 mol/L NaOH 标准溶液.因此必须要用基准物质标定其准确浓度。 标定所用基准物质是邻苯二甲酸氢钾，容易制得纯品，不含结晶水，在空气中不吸水，容易保存，摩尔质量大，比较稳定，是较好的基准物质。它与氢氧化钠的反应式为： 化学计量点的产物邻苯二甲酸钾钠是二元弱碱，因此化学计量点时的溶液为弱碱性,选用酚酞作指示剂，滴定终点由无色变为浅红色。 氢氧化钠的摩尔浓度计算公式(mol/L)： 1000a ?= OH N NaOH V M m c 邻苯二甲酸氢钾 邻苯二甲酸氢钾