微载体培养技术
(microcarrier culture technique)
一、微载体培养应用此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。经过三十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。
使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTATB反应器，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。
二、微载体是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。
●微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。
●微载体的密度：一般为，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。
●微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。
三、微载体培养原理与操作
1.原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。
贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。
2. 搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。
3.细胞与微载体的相融性，是与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理PH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为
媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。
4. 细胞在微载体表面的生长影响细胞在微载体表面生长的因素很多，主要有三个方面。
●在细胞方面，如细胞群体、状态和类型。
●在微载体方面，如微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。
●在培养环境中，如培养基组成、温度、pH、DC以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。
5. 微载体培养操作要点
●培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的PH与温度水平，接种细胞（对数生长期，而非稳定期）至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。
●贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。
●培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随意细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液：停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37℃），重新开始搅拌。
●收获细胞：首先排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，快速搅拌（75-125r/min）20-30min。然后解离收集细胞及其产品。
●微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至4000L以上。
四、微载体大规模细胞培养的生物反应器系统此技术大规模培养，细胞扩增的效率受到诸多因素的影响和限制，其中主要的限制性因素包括：细胞对剪切力的敏感性、氧的传递以及传代和扩大培养等。而研制的各种类型生物反应器系统则可针对上述限制性因素，为微载体细胞培养与扩增提供低剪切力、高氧传递效率、易于细胞传代等适宜的外部环境。已较多使用的微载体培养系统生物反应器，可以实行计算机控制操作，培养搅拌速度及悬浮均匀程度、温度变化、PH稳定及溶氧供应（O2、N2、CO2、空气四种纯化气体按比例调节）、罐压、培养体积和通气量等参数全部由电脑自动控制。因此，应用生物反应器系统进行微载体细胞大规模扩增具有明显优势，目前国外相继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统，如搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统以及灌注式生物反应器系统等。
1、搅拌式生物反应器系统搅拌式生物反应器系统在微载体细胞大规模扩增研究领域已有较长的研究历史，但因该细胞培养系统容易产生过大的剪切力，从而限制了其应用范围。尽管如此，由于该系统具有简单、实用及价格低廉等特点，国内外仍有不少应用该系统成功进行细胞大规模扩增的研究报道。例如，Werner A（2000年）成功地在该系统内进行了肝细胞大规模扩增的研究。
2、灌注式生物反应器系统灌流培养是目前研究热点之一。它的特点是不断地加入新鲜培养基以及不断地抽走含细胞代谢废物的消耗培养基，使细胞得以在一个相对稳定的生长环境内
增殖，即省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，且可以提高细胞密度10倍以上。
3、旋转生物反应器近年来，旋转生物反应器系统（RCCS）已经成为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常用细胞培养系统。该系统是基于美国航空航天局为模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器。RCCS既可以用于微载体大规模细胞培养，又能在其内培育细胞与支架形成的三维空间复合体。至今，近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。
五、微载体培养优点
●表面积/体积（S/V）大，因此单位体积培养液的细胞产率高；
●把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；
●可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；
●简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；
●培养基利用率较高；
●放大容易；
●细胞收获过程不复杂；
●劳动强度小；
●培养系统占地面积和空间小。
微载体培养技术 (microcarrier culture technique) 一、微载体培养应用此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。经过三十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。 使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTAT?B反应器，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。 二、微载体是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。 ●微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。 ●微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。 ●微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。 三、微载体培养原理与操作 1.原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。 贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。 2. 搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。 3.细胞与微载体的相融性，是与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理PH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电
一种新型微载体的制备及其细胞培养 发表时间：2018-09-17T16:08:43.697Z 来源：《基层建设》2018年第25期作者：韦楚旭 [导读] 摘要：一种用于动物细胞培养的新型微载体：利用葡聚糖和环氧氯丙烷进行交联反应，得到葡聚糖凝胶，即微载体，并用精氨酸对微载体进行修饰，使微载体在细胞培养液中表面带上正电荷，进而吸附细胞，使细胞贴附在表面生长。 身份证号：44528119871020XXXX 510000 摘要：一种用于动物细胞培养的新型微载体：利用葡聚糖和环氧氯丙烷进行交联反应，得到葡聚糖凝胶，即微载体，并用精氨酸对微载体进行修饰，使微载体在细胞培养液中表面带上正电荷，进而吸附细胞，使细胞贴附在表面生长。由于精氨酸酸性羧酸酯基团，这个方案为细胞培养提供了与市售Cytodex 1微载体相比具更低的表面pH，理论上表面pH值可以做到7.0左右，其结果是更适宜pH的微载体。将产物初步用于VERO细胞培养，得到了较好的结果。细胞在微载体上生长良好，和目前广泛使用的Cytodex 1微载体效果相仿。 关键词：微载体、精氨酸、胍基、动物细胞培养 动物细胞培养常常需要贴壁生长，在悬浮状态下细胞生生长缓慢，停止，甚至死亡。微载体培养细胞原理是将对细胞无害的颗粒—微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使贴壁细胞在微载体表面附着生长，而同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。它将细胞的贴壁培养变为悬浮培养，这样可以大大增加细胞生长的表面积以提高细胞的生长密度。精氨酸（以下简称Arg）可以算为一种双性氨基酸，因为在其双键及氮孤立电子对之间的共轭体系，使得其正电殛离开原位。这个胍基能形成多重的氢键。使其在中性、酸性或碱性的环境下都是带正电。葡聚糖凝胶含有大量的羟基，且此羟基可被氧化成醛或酮或羧酸，适合作为微载体基体，利用这个性质，将精氨酸偶联在葡聚糖羟基上。 1、微载体制备 1.1微载体基体制备 1.1.1试剂规格：①葡聚糖（分子量为10000，分析纯）；②环氧氯丙烷（分析纯）；③Span80（分析纯）；④液体石蜡（分析纯）；⑤95%酒精（医用级）；⑥氢氧化钠（分析纯） 1.1.2制备方法：取50mL石蜡油加入100mL的烧杯中，然后放入水浴槽中，温度加热至50℃，开启搅拌，加入1mL span80，搅拌10min 后，等烧杯内温度达到50℃，加入10mL葡聚糖溶液（浓度为20%，10%氢氧化钠），继续搅拌20min，让葡聚糖溶液在石蜡油里面形成一个油包水体系，葡聚糖以小液球形式悬浮在石蜡油中，待乳化稳定后，加入3mL 环氧氯丙烷交联固化，反应20min，然后将反应温度升至75℃，继续反应40min。然后取样观察载体固化程度，取1mL样品，加入10mL离心管中，然后加入5mL95%酒精，大力摇匀，然后静置2min，去除液体，如此方法重复3遍，最后得到脱水的载体，往试管加入5mL纯化水，摇匀2min，取样400倍显微镜下观察，固化好的载体经酒精脱水处理之后，再吸水膨胀恢复为无色透明光滑球体，载体无裂痕。固化完成后，停止加热和搅拌，静置，待载体沉淀后去除上清，加入100mL纯化水，开启搅拌，搅拌10min，然后停止搅拌，静置，待载体沉淀后去除上清；重复以上步骤清洗载体，直到石蜡油完全去除；并用筛网筛选其中150～250μm的微球，将筛选好的微载体加入5mL 0.5mol/L的氢氧化钠溶液，密封保存待用。 1.2微载体修饰 1.2.1试剂规格：硫酸钠（分析纯），氢氧化钠（分析纯），硼氢化钠（分析纯），烯丙基缩水甘油醚（分析纯），乙酸（分析纯），醋酸钠（分析纯），L-精氨酸（BR级），饱和溴水（分析纯），甲酸钠（分析纯），酒精（95%，医用级）。 1.2.2制备方法：取10mL1.1制备好的微载体加入100mL的烧杯中，加入10mL纯化水和10.5g 硫酸钠，以活化微载体凝胶上面的羟基，然后放入水浴槽，温度加热至30℃，开启搅拌，反应10min；然后加入5.4g氢氧化钠和1.9g硼氢化钠，然后将微载体加热至65℃，加入20mL烯丙基缩水甘油醚，在硼氢化钠的催化下烯丙基结合在羟基上，65℃下反应2小时，反应2小时后加入乙酸中和至pH6.5-7.5之间，以终止反应，接着用4倍体积的纯化水反复洗涤5次，再用3倍95%酒精洗涤5次，最后用6倍纯化水洗涤5次，最后沉淀去上清待用。将上面烯丙基化的微载体加入15mL水和0.25g 醋酸钠，开启搅拌，然后加入2ml饱和溴水，反应继续进行5min，再加入HCOONa终止反应，搅拌反应 30min，然后沉淀去除上清液。将上面的微载体加入5mL水和0.5g精氨酸，将反应温度加入至60℃，并用氢氧化钠溶液（10%，W/W）调pH 至10.3，在30min和60min后测量pH值，并调至10.3，然后60℃下反应4个小时。待反应完成后，用乙酸将pH值调至6.5-7.5之间，静置 10min，然后去除上清，接着依次用2倍体积的缓冲液（pH为8.0）和2倍体积的缓冲液（pH为4.0）洗涤，共8次循环，最后用8倍体积水洗涤。将洗涤好的载体加入玻璃瓶中，加入pH值为7.4的PBS缓冲液，121℃高温灭菌30min，常温密封保存待用。 2.细胞培养 2.1细胞株和培养基：采用非洲绿猴肾细胞（VERO细胞），培养基为DMEM，加10%胎牛血清、0.5g/L 谷氨酰胺，0.2μm过滤除 2.2载体准备：分别各称1克市售GE的Cytodex 1和Cytodex 3干粉，分别置于100ml的烧杯中，加入50ml pH值为7.4的PBS缓冲液中溶胀1h，去除上清，再次加入50ml PBS浸泡1h，然后各取10ml微载体置于100ml搅拌瓶中；取10ml精氨酸微载体置于100ml搅拌瓶中。将以上3个搅拌瓶121℃灭菌待用。 2.3细胞培养：先将VERO细胞225方瓶中培养至致密单层，然后胰酶将方瓶中的细胞消化下来，平分3份，然后分别加入到3个带有微载体的搅拌瓶中，加入30ml培养基，置37℃培养箱中搅拌培养，搅拌转速为30r/min，逐日取样换液。 2.4细胞计数：取样1mL于10mL试管中，待多孔微载体沉降后用吸管尽可能多地吸出上清，尔后加入含0.1%结晶紫的0.1mol/L柠檬酸溶液，使总体积至 5mL，每隔1h用吸管吹打、摇荡，置于37℃下 3h后，摇匀待微载体稍沉降后，用吸管紧靠液面吸取适量液体于血球计数板上，数出被染成深紫色的细胞数。 3.结果与讨论 3.1细胞在微载体上面的贴壁 接种细胞后，每间隔半小时取样一次，测定培养液内游离细胞浓度，用接种细胞浓度减去游离细胞浓度，即为贴附在微载体上的细胞。虽然培养初期，细胞在不同微载体上的贴壁速度不同，但随吋间的延长，细胞附着率逐渐接近，接种3小时后，细胞贴壁率均可达80%以上，12小时后，细胞全部附着在微载体上，培养基内无活的游离细胞存往。 3.2细胞在微载体上面生长 细胞贴附在微载体表面后，开始扩张生长，细胞浓度逐渐增大，没有附着在微载体上的细胞丧失活力。培养120小时后细胞浓度可达
微载体培养动物细胞技术的研究与进展 摘要： 微载体是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。微载体具有比表面积大等优点，在微载体培养技术中具有决定性作用。而微载体细胞培养技术是一种微载体与生物反应器结合的技术,现已广泛应用于组织工程领域"组织工程生物反应器系统能使细胞体外培养条件接近体内环境。报告就近年来制备微载体的生物材料和方法探究技术以及其在培养动物细胞的研究进展做一综述，为微载体培养技术和组织工程的研究提供理论基础。 关键词：微载体、载体类型、细胞培养、综述文献 引言： 荷兰学者van Wezel 于1967年首先创立了。微载体培养动物细胞技术。在微球表面培养细胞可以在较短时间内得到大量的细胞，且细胞传代只需要添加新的微载体，基本上可避免细胞在胰酶消化过程中受到的损伤，因此微载体培养细胞技术是非常方便和有意义的。20世纪80年代，微载体出现了商品化。Famarcia 公司利用中性葡聚糖凝胶表面偶联正电荷基团开发出Cytodex 1、Cytodex 2和Cytodex 3系列商品，但这些微载体由于通过特殊处理都不具有降解性或降解性较差，且价格昂贵。而理想的微载体则应具有良的生物相容性、降解可吸收性。因此，优质微载体生物材料的开发仍是当前研究热点。本文综合分析近年来国内外微载体制备材料和方法的研究进展，为细胞微载体培养技术和组织工程的研究提供理论基础。 1 资料和方法： 1.1 资料来源 由第一作者在CNKI进行检索。网址：https://www.doczj.com/doc/e95259243.html,/。英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。英文检索词为“microcarrier，biomaterials cellculture, tissue engineering”；中文检索词为“微载体，生物材料，细胞培养，组织工程”。 1.2 入选标准
细胞培养基本操作技能 无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 实验用品 1. 种类︰ 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透 明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗︰ 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌︰ 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于
MDCK细胞培养 一、目的MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。 二、适用范围适用于疾控中心所有技术人员。 三、程序 （一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-1所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。 （二）材料 1.生长成片的MDCK细胞 2.无菌的T25细胞培养瓶 3.D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 4.青、链霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃ 5.HEPES缓冲液，1M母液 6.胎牛血清 7.EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mMEDTA-4Na），分装后保存于-20℃8.7.5%牛血清白蛋白组分V9.1mL、10mL无菌移液管10.70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 （三）实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 1.D-MEM培养液的准备 500mLD-MEM液中加入：青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素），HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL 2.细胞生长液的准备 胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 3.首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 4.温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
5.重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 6.加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。 7.加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 8.取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞） 9.每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。 10.于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体内、外细胞的差异和分化
1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。第二节细胞培养的一般过程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
细胞培养技术 第一章细胞培养的基本原理与技术 现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。 第一节体外培养的概念 一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 ●组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 ●细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 ●器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。 第二节细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，
细胞培养技术相关知识简介 一.培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期 1.1 潜伏期(latent phase) 细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。 1.2 指数增生期(logarithmic growth phase) 这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact inhibition)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。 1.3 停滞期(Stagnate phase) 细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期。此时细胞数持平，故也称平台期（Plateau phase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。如不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒，出现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重的会发生死亡。 为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
第一章细胞培养的基本原理与技术 现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以 CHO 细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。 第一节体外培养的概念 一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体或其寄生体取出，放在类似于 体生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 ●组织培养：是指从生物体取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 ●细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 ●器官培养：是指从生物体取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体细胞相同的基本结构和功能，也有一些
细胞培养技术练习题 选择题1.接种工具灭菌常采用（A） A.灼烧 B.高压 C.过滤 D.熏蒸 2.具有促进愈伤组织生产的物质是（B ） A.维生素PP B.维生素B1 C.维生素B6 D.甘氨酸 3.微量元素母液的配制浓度（ B ）A.10倍 B.100倍 C.1mg/ml D.10mg/ml 4.配制10倍大量元素母液，所需硝酸铵（C ）mg A.9000 B.3700 C.16500 D.4400 5.配制100倍有机物母液时，所需维生素B1( B )mg A.0.4 B.10 C.100 D.0.1 6.下列哪种不是组织培养常用的维生素（A）A.维生素B2 B.维生素B1 C.维生素B6 D.维生素C 7.下列哪种激素不属于生长素类（ C ）A.IAA B.IBA C.6-BA D.NAA 8.下面哪种是MS培养基大量元素所用药剂（A）A.硫酸镁 B.硫酸亚铁 C.硫酸锌 D.硫酸铜填空：1、组织块的分离方法有机械分散法、剪切分离法、消化分离法。 2、目前，较常用的消化试剂有胰蛋白酶、胶原酶、EDTA消化液。 3、接种培养瓶的细胞数量一般为5×105-1×106/ml 。 4、培养细胞的污染一般包括微生物污染、细胞交叉污染、化学物质的污染。 5、细胞冻存时DMSO常用的浓度为10%的浓度。 1. 体外培养的动物细胞其生长方式主要贴壁生长和悬浮生长两种，分别称为贴壁型细胞和悬浮型细胞。体外培养的动物细胞其生长方式以贴附生长为主。 2. 贴壁生长的体外培养动物细胞，按形态来分，大体分为成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多形细胞型四种类型，最常见的为前两种。 3. 细胞在体外生长时具有一些特点，其中主要是贴附生长、接触抑制和密度依赖性。 4. 培养细胞生命期可分为原代培养期、传代培养期、衰退期三个阶段。 名词解释1、原代培养：原代培养也叫初代培养，是从供体进行细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。 2、组织块培养法：组织块培养是将组织剪切成小块后，接种于培养瓶进行培养。组织块培养法是常用的，简便易行的以及成功率较高的原代培养方法。 3、消化培养法：消化培养法是采用组织消化分散法将细胞间质包括基质、纤维等妨碍细胞生长的物质去除，使细胞分散，形成悬液，从而易于外界吸收养分和排出代谢产物. 4、细胞生长曲线：细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。以培养时间为横轴，细胞浓度为纵轴作图，即得生长曲线。 5、传代：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。 问答题：1、如何得到单细胞无性系？在细胞培养中，常由分散性较好的愈伤组织或悬浮培养物来制备单细胞，也可以用纤维素酶和果胶酸酶从植物不同组织直接制备单细胞。由分离的单细胞经看护培养法、微室培养法或平板培养法，即可得到单细胞无性系 2、单细胞培养有哪些方法？各有何含义及特点单细胞培养：看护培养；微室培养；平板培养 （1）看护培养法是指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 特点：①简便易行。②效果好，易于成功。③不能在显微镜下直接观察细胞生长过程。 （2）微室培养：即将细胞培养在很少量的培养基中。 特点：在培养过程中可连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。 （3）平板培养法是把单细胞悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合，平铺一薄层在培养基底上的培养方法。 特点：可以定点观察；分离单细胞系比液体浅层培养容易；培养细胞气体交换不畅。 3、说明每一种单细胞培养方法的要点？ （1）看护培养：①小三角瓶中加1cm厚的固体培养基，灭菌②将1cm大小的愈伤组织块放在培养基中央。③在愈伤组织块上放1cm2无菌滤纸片，培养室中过夜④将单个细胞接种在滤纸上面⑤培养室培养f1个月可见愈伤组织小块，2-3个月得到单细胞无性繁殖系。（2）微室培养：①载玻片和盖玻片火焰上消毒②在载玻片上涂一圈四环素眼膏，放一小段毛细管。滴一小滴细胞悬浮液于凹穴中③盖上盖玻片，使之与悬浮液接触（3）平板培养：①制备单细胞悬浮液：用酶法或机械震荡法将组织器官游离出单细胞。经过滤后的滤液即是。②悬浮液密度的调制：a通过显微镜，观察记数板凹槽中的悬浮液细胞数，并计算其密度。b一般平板培养要求细胞密度为1′103-1′105。③培养基的配制：1）1.4%琼脂培养基; 2)0.7%琼脂的条件培养基。④平板制作：按1:2或1:4混合，制成3mm厚的平板。⑤培养：26°C暗培养21d，计算细胞团数，计算植板率 4、什么是细胞悬浮培养？简述成批培养和连续培养的的特点？细胞悬浮培养：是使离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。（1）成批培养的特点：①细胞生长在固定体积的培养基上，直至养分耗尽②用搅拌的方法使细胞团和细胞均匀分布③细胞数目呈现慢—快—慢—停止生长的变化d必须更换新鲜培养基才能进行下一批培养（2）连续培养的特点：①由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象②可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。细胞增殖速度快③适于大规模工业化生产
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高你认为该如何保证器皿中无杂质如果器皿 中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的 镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、 细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗如果不精确，会导致什么后果请举例说明。你认 为精确配制各种溶液 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为左右。苯酚红的变色域：（橙）~（黄），（棕色）~（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的 消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌 呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞 有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用小牛血清在细胞培养中有哪些作用 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。② 作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某 些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热 源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则 营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。