酶标抗体制备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性。用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。
（一）辣根过氧化物酶标抗体制备技术
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺（DAB）为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在～12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。
凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色剂。供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。前者最常用的为3，3‘二氨基联苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种；但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。
用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。
1、改良过碘酸钠法
HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的结合物。
[标记步骤]
（1）取5mg HRP溶于蒸馏水，加入1%2，4而二硝基氟苯（DNFB）无水乙醇溶液，室温（20℃±）下轻微搅拌作用1h。
（2）加入1mL L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
（3）加入L乙二醇，室温（20℃±）下轻搅作用1 h，终止氧化反应。
（4）加入5mg抗体（Ig），装入透析袋，置L，碳酸盐缓冲液（无水碳酸钠，碳酸氢钠,蒸馏水加至1 000 mL）1 000 mL中，4℃透析过夜，更换3次。
（5）取出透析袋中液体（约3 mL），加入5mg/mLNaHB4 mL 4℃ 2h 或过夜。
（6）加50%饱和硫酸铵（NH4）2SO4溶液（硫酸铵850g，蒸馏水加至1 000 mL，以30%氨水调）6 mL沉淀结合物，置4℃30min后，3 000r/min 离心30min，取深沉（SPA不需要进行此步）。
（7）将沉淀物溶于PBS（）中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。
（8）在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/ mL，或加等量60%甘油，测定工作效价后，小量分装（或冻干，不需加甘油），低温保存备用。
2、戊二醛交联法
戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与HRP 和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白结合物。反应可在4-40℃温度范围，～的缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法，戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。
[标记步骤]
（1）取10mgHRP溶于 %戊二醛(用L、将25%戊二醛稀释为%)，室温（20℃左右）反应结合18h。
（2）用LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用L，，4℃透析过夜。
（3）将5mg抗体IgG溶于L NaCl，再与醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。
（4）加入 1mol/L 碳酸盐缓冲液（调节pH至～），4℃，电磁搅拌下结合24h。
（5）加入赖氨酸（溶于10mL蒸馏水），4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
（6）装入透析袋，以L、 PBS，4℃透析过夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分装，4℃或-20℃保存。
（二）过氧化物酶
简介
抗过氧化物复合物制备技术
Stemberger(1970)等，首先报道了过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物（peroxidase-antiperoxidase,PAP）法，此法也称为非标记抗体酶法（unlabelled antibody enzymemethod）。PAP法不需用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的影响，可大大提高免疫酶法的灵敏度。
标记步骤
（1）取5mL抗HRP血清，16 000r/min 4℃离心20min，取上清液。
（2）加入1mL HRP(2mg/mL)溶液混匀，室温（20℃±）静置1h，16 000r/min，4℃离心20min，取沉淀物。
（3）加冷生理盐水反复洗涤-离心（16 000r/min，4℃离心20min）3次，弃上清，取沉淀物。
（4）加入过量HRP溶液4mL（2mg/mL）混匀后，移至小烧杯内。
（5）在pH计监控下，边搅拌边加入及L HCl调至左右，使沉淀完全溶解。
（6）立即加入LnaOH,调，16 000r/min，4℃离心20min，取上清液。
（7）加入1/10体积的L醋酸钠和L醋酸铵的等量混合液后混匀。
（8）电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，并继续搅拌10min，4℃放置20min，16 000r/min，4℃离心20min，去上清，取深沉物。
（9）以50%饱和硫酸铵洗涤，4℃、16 000r/min×20min，离心2次，取深沉物。
（10）加5mL蒸馏水将深沉物溶解后装入透析袋，用醋酸盐缓冲液（生理盐水、蒸馏水、75mL L醋酸钠及75mL粉酶3moL/L醋酸铵）4℃透析3d，每天换液2次。
（11）17 000r/min，4℃离心20min，取上清液进行工作效价鉴定。
（12）加等量60%甘油，小量分装，-20℃保存。
（三）McAb-PAP制备技术
用抗HRP McAb制备PAP复合物的工艺条件较为简便，而且不需严格的条件限制。用小鼠抗HRP McAb制备的腹水，按一定的HRP/IgG克分子比混和，置37℃水浴反应2h，即成鼠PAP复合物。以按HRP/IgG克分子比为4︰1制备为宜。
（四）碱性磷酸酶标抗体制备技术
简介
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。从小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为；从大肠杆菌中提取酶分子量为80kDa，最适pH为。它的作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐（PNP）、β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶名疫测定。AP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。
标记步骤
（1）取抗体（2～5mg/mL）1mL，加入AP 5mg溶解。
（2）装入透析袋，用L、℃透析18h，换液3次。
（3）加入%戊二醛20uL，室温（20℃±）放置2h。4℃L、透析过夜，换液3次。
（4）移入L、缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次。
（5）取出标记抗体，用含%BSA和%NaN3的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原液。
（6）加入1/3量纯甘油，测定工作效价后，小量（）分装，4℃保存（使用前以吐温溶液将结合物适当稀释）。
（五）碱性磷酸酶
-抗碱性磷酸酶复合物制备技术
Mason等（1978），用碱性磷酸酶代替过氧化物酶，建立了碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物（APAAP）桥联酶标技术。但以AP作为抗原用常规免疫方法制备的抗血清，很难达到APAPP桥联酶标技术的质量要求，在一定程度上限制了此项技术的推广使用。杨志刚等（1989）利用抗AP的McAb建立了一种制备APAAP复合物的简便方法。只需将AP和抗AP的McAb以适当比例混合，4℃结合过夜即可使用。采用改良的ELISA方法检测APAAP复合中AP的最适含量。具体方法是：用羊抗鼠Ig包被微量滴定板；加入一定量的抗APMcAb；分别加入不同量的AP作用后经过洗涤；加底物显色，测定光密度值（OD）。
在一定范围内，APAAP复合物溶液中AP含量增加的同时，相应的OD值也随之增大；当AP增加到一定量时（约6～8mg/mL）、OD值保持稳定。
第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术 本章考点 1.概念 2.杂交瘤技术基本原理 3.杂交瘤抗体的制备技术 4.基因工程抗体 由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。 传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。 第一节杂交瘤技术基本原理 单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 一、B细胞杂交瘤技术 1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。 2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT 培养基上长期存活与繁殖。 3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
【最新整理，下载后即可编辑】 酶标抗体制备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性。用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。 （一）辣根过氧化物酶标抗体制备技术 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。 HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺（DAB）为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在 pH3.5～12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。 凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色剂。供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。前者最常用的为3，3‘二氨基联苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、
酶标抗体制备技术 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉(辅基)构成一种糖蛋白(含糖18%)。此酶溶于水 和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。HRP分子量较小(40kDa)，标记物容易穿透入细胞内部;作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺(DAB)为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察;在pH3.5~12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min;用甲苯与石腊 包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片 均不影响其活性;溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解 5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故 常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化;氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物(供氢体)都可以用显色剂。供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。前者最常用的为3，3'二氨基联苯胺 (3,3'diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法;反应后的 氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物;这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，
适用电镜检查;此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别;易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种;但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛 (glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。改良过碘酸钠法HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4)还原成稳定的结合物。[标记步骤](1)取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2，4而二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液0.1mL，室温(20℃±)下轻微搅拌作用1h。(2)加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。(3)加入1mL0.16mol/L乙二醇，室温(20℃±)下轻搅作用1 h，终止氧化反应。(4)加入5mg抗体(Ig)，装入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液(无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g,蒸馏水加至1 000 mL)1 000 mL中，4℃透析过夜，更换3次。(5)取出透析袋
抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～ 1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
一、目的要求 ·掌握：特异性抗体的类型、杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理；熟悉：常用颗粒性和蛋白质抗原制备的方法、多克隆抗体制备的的影响因素，常用佐剂种类；了解：抗血清的鉴定，基因工程抗体的类型。 第十四章 特异性抗体的制备技术 Chapter 14 Preparation of Specific Antibody 第一部分 教学内容和要求 二、教学内容 1. 常见免疫原的种类和制备及佐剂。 2. 免疫血清的制备，抗血清的鉴定与保存。 3. 单克隆抗体制备技术。 4. 基因工程抗体技术。 第二部分 测试题 一、选择题 （一）单项选择题（A 型题） 1.配制绵羊红细胞免疫原一般细胞浓度为 A.102 /ml B.104 /ml C.105 /ml D.106 /ml E.108/ml 2．细菌鞭毛免疫原常规的制备方法 A ．0.5%甲醛处理 B ．100℃加温 2h 处理 C ．1%氯化钙处理 D. 75%乙醇处理 E.2% 氯肪处理 3. 细菌的菌体免疫原常规的制备方法 A. 75%乙醇处理 B. 100℃加温 2h 处理 C. 0.5%甲醛处理 D. 1%氯化钙处理 E.2%氯肪处理 4. 要从组织和细胞匀浆中粗提某种蛋白抗原，最常用又简便的分离方法 A. 盐析法 B. 凝胶过滤法 C. 离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E. 免疫电泳法 5. 制备人工抗原时，最常用于偶联半抗原的载体 A. 免疫球蛋白 B. 人甲状腺球蛋白 C .人血清白蛋白 D. 牛血清白蛋白 E. 葡萄球菌 A 蛋白 6. 蛋白质抗原首次免疫接种后，最好间隔多长时间再进行第二次免疫 A . 7~10 天 B. 10~20 天 C. 20~30 天 D. 30~60 天 E. 三个月 7. 鉴定抗体的效价，最好采用下列哪一种方法 A. 间接凝集试验 B.单向免疫扩散法 C.双向免疫扩散法 D.免疫亲和层析法 E.聚丙烯酰胺凝胶电泳法 8. 纯化特异性抗体时，可采用下列哪种方法除去杂抗体 A. 盐析法 B.凝胶过滤法 C. 离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法 9. 根据抗原分子所带电荷不同进行分离纯化的方法称为 A. 盐析法 B.凝胶过滤法 C.离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法 10。单克隆抗体目前效果较好的纯化方法 A 。亲和层析法 B 。凝胶过滤法 C 。离子交换层析法 D 。超速离心法 E 。盐析法 11. 完全佐剂的组成 A.液体石蜡+羊毛脂 B.羊毛脂+氢氧化铝 C. 液体石蜡+卡介苗+氢氧化铝 D.卡介苗+氢氧化铝 +羊毛脂 E. 卡介苗+液体石蜡+羊毛脂 12. 要使半抗原与载体结合具有免疫原性、半抗原分子的数目数至少要达到 A.10 个以上 B.15 个以上 C.20 个以上 D.50 个以上 E.100 个以上 13．颗粒性抗原免疫接种方法一般采用 A ．淋巴结注射 B ．静脉注射 C ．皮内注射 D ．皮下注射 E ．肌肉内注射 14。免疫小鼠采血通常采用 A ．心脏采血或断尾法 B ．颈动脉放血或断尾法 C ．颈静脉或摘除眼球采血 D ．摘除眼球或断尾法 E ．耳静脉采血或摘除眼球 15. 较长时间(4~5 年)保存抗体，通常采用 A. 4℃保存 B ．-10℃保存 C ．-20℃保存 D ．-30℃保存 E ．真空干燥保存
单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
单克隆抗体制备的技术原理 单克隆抗体是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的抗体，具有单一、特异与纯化的特性。该抗体在医学临床诊断及治疗上具有极其重要的作用。因此它的问世在现代免疫学上具有划时代的意义。 大家知道，当外源性物质在人体或动物血液中出现时，机体中有一些淋巴细胞便会做出反应，产生一些特殊的免疫球蛋白，叫做抗体。而那些外源性物质则称为抗原。抗体与抗原能发生特异结合，从而清除异物，达到保护肌体的作用。抗原不同，它所诱发的抗体也不一样。如细菌或病毒表面存在着几种抗原，因此它们就会对应地诱发出几种不同的抗体。过去人们为了获得抗体，就根据上述原理，反复注射某种抗原到动物（如兔、羊、马等）体内，然后从其血清中分离出所需的抗体。长期以来，用这种经典方法得到的抗体，往往存在着两个严重的缺点：第一，这些抗体不是均质的，而是一种抗体的混合物，特异性差，效价低；第二，抗体的产生是有限量的，因为分泌抗体的成熟淋巴细胞寿命很短，一般只能存活几天，无法大量生产。 为了克服上述缺点，许多免疫学家曾进行了长期的研究与探索，这一难题终于在1975年被国外两名免疫学家考勒和米尔斯坦解决了。他们利用自己创立的杂交瘤技术，使产生抗体的淋巴细胞能在体外长期存活，并源源不断地分泌抗体。这就是有高特异性和非常均质的单克隆抗体。 单克隆抗体的技术原理并不十分复杂。它是把能产生单一抗体的淋巴细胞与有增殖能力的骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，又称杂交瘤。由于这些杂种细胞继承了双亲细胞的遗传物质，因此它们不仅能表现出淋巴细胞分泌单一抗体的能力，而且还能表现出骨髓瘤细胞在体外大量繁殖的本领。就这样，取长补短，使杂交瘤变成了一座制造单克隆抗体的理想“工厂”。 目前制备单克隆抗体的具体方法，主要有以下三步（图2－9）。 第一步：将抗原注射到小鼠体内进行免疫，取出受免脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合。 第二步：用选择培养基，选出杂交瘤细胞，逐一克隆或扩增，从中挑出能产生抗体的杂交瘤细胞。 第三步：将杂交瘤细胞接种在培养瓶中扩大培养或注射到动物的体液中作为腹水癌生长，然后再分离纯化单克隆抗体。
第十四章特异性抗体的制备技术 Chapter 14 Preparation of Specific Antibody 第一部分教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：特异性抗体的类型、杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理；熟悉：常用颗粒性和蛋白质抗原制备的方法、多克隆抗体制备的的影响因素，常用佐剂种类；了解：抗血清的鉴定，基因工程抗体的类型。 二、教学内容 1．常见免疫原的种类和制备及佐剂。 2．免疫血清的制备，抗血清的鉴定与保存。 3．单克隆抗体制备技术。 4．基因工程抗体技术。 第二部分测试题 一、选择题 （一）单项选择题（A型题） 1.配制绵羊红细胞免疫原一般细胞浓度为 A.102 /ml B.104 /ml C.105 /ml D.106 /ml E.108/ml 2．细菌鞭毛免疫原常规的制备方法 A．0.5%甲醛处理B．100℃加温2h处理C．1%氯化钙处理 D. 75%乙醇处理 E.2%氯肪处理 3. 细菌的菌体免疫原常规的制备方法 A. 75%乙醇处理 B. 100℃加温2h处理 C. 0.5%甲醛处理 D.1%氯化钙处理 E.2%氯肪处理 4.要从组织和细胞匀浆中粗提某种蛋白抗原，最常用又简便的分离方法 A. 盐析法 B. 凝胶过滤法 C. 离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E. 免疫电泳法 5.制备人工抗原时，最常用于偶联半抗原的载体 A. 免疫球蛋白 B. 人甲状腺球蛋白 C .人血清白蛋白 D. 牛血清白蛋白 E. 葡萄球菌A蛋白 6.蛋白质抗原首次免疫接种后，最好间隔多长时间再进行第二次免疫 A . 7~10天 B. 10~20天 C. 20~30天 D. 30~60天 E. 三个月 7.鉴定抗体的效价，最好采用下列哪一种方法 A.间接凝集试验 B.单向免疫扩散法 C.双向免疫扩散法 D.免疫亲和层析法 E.聚丙烯酰胺凝胶电泳法 8.纯化特异性抗体时，可采用下列哪种方法除去杂抗体 A.盐析法 B.凝胶过滤法 C. 离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法 9.根据抗原分子所带电荷不同进行分离纯化的方法称为 A.盐析法 B.凝胶过滤法 C.离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法 10。单克隆抗体目前效果较好的纯化方法 A。亲和层析法B。凝胶过滤法C。离子交换层析法D。超速离心法E。盐析法 11.完全佐剂的组成 A.液体石蜡+羊毛脂 B.羊毛脂+氢氧化铝 C. 液体石蜡+卡介苗+氢氧化铝 D.卡介苗+氢氧化铝+羊毛脂 E. 卡介苗+液体石蜡+羊毛脂 12.要使半抗原与载体结合具有免疫原性、半抗原分子的数目数至少要达到 A.10个以上 B.15个以上 C.20个以上 D.50个以上 E.100个以上 13．颗粒性抗原免疫接种方法一般采用 A．淋巴结注射B．静脉注射C．皮内注射D．皮下注射E．肌肉内注射14。免疫小鼠采血通常采用 A．心脏采血或断尾法 B．颈动脉放血或断尾法 C．颈静脉或摘除眼球采血 D．摘除眼球或断尾法 E．耳静脉采血或摘除眼球 15．较长时间(4~5年)保存抗体，通常采用 A．4℃保存 B．-10℃保存 C．-20℃保存 D．-30℃保存 E．真空干燥保存
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
酶标抗体制备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性。用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。 （一）辣根过氧化物酶标抗体制备技术 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。 HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺（DAB）为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在～12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。 凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色剂。供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。前者最常用的为3，3‘二氨基联苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种；但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。 用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。 1、改良过碘酸钠法 HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的结合物。 [标记步骤]
人源化单克隆抗体的构建技术 摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。 关键词：人源化，单克隆抗体，构建 从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1]，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点[2]。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。 人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。 1 嵌合抗体的构建 抗体分子与抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）。将小鼠单克隆
实验室实验： 1.蛋白表达纯化过程见具体protocol， 2.蛋白纯化好后，跑胶鉴定，估计大概迁移量 3.将纯化好的蛋白跑一到两块胶，（大概需要1-2g蛋白，需要估计蛋白量） 4.跑完胶后，用100mM KCl浸泡，几分钟后会出现发白条带， 5.把该条带割下来，（原则：割带尽量小，减少等量蛋白中对应的胶块的含量，胶块含量 过高会导致兔子死亡） 6.在-80度冷冻1h以上，然后到三楼冷冻干燥仪冻干， 7.将冻干的胶块捣碎（方便注射），可以在割胶时先切成碎小块，在楼上用玻璃棒之类的 东西捣碎 8.分成四份，107路或317路送去中医药大学动物实验中心进行注射 9.抗体样品取回后，用纯化过的蛋白进行效价测定，并记录 10.抗体溶液用硫酸铵沉淀， 11.溶解后加50%甘油混匀，分管保存 12.管子上标记蛋白号，记录上详细记录抗体效价，质量，杂信号状况 附抗体制备
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳 【实验目的】 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 一、多克隆抗体的制备 【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。 【实验材料】 ⒈ 实验动物 初次抗原注射后的周次 0 1 2 3 4 5 6 7 初次免疫 二次免疫 血 清 中 抗 体 的 水 平
《现代免疫学实验技术》 HRP标记抗体的制备用HR标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。常用的交联剂为戊二醛和过碘酸钠。 (1)戊二醛交联法戊二醛(掣utaralde—hYde，CHO-(CH，)：—CHO)是一种常用的同型双功能交联剂，它的两个醛基可分别与HRP(正)和抗体蛋白(P)的氨基形成Schiff氏碱(—N=C—)，将两个分子以五碳桥连接起来。 图5—10 戊二醛交联酶与抗体的反应式 戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一。可在4—40~C温度范围，pH6．0—8．0的缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法。一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。此法操作简便，适用于各种酶一抗体(抗原)系统。但由于不同的酶所含氨基的数量不同，其交联产物不均一，除形成酶一抗体结合物外，酶与酶、抗体与抗体之间也可发生交联。并且对不同酶的交联率也不相同，HRP的交联量一般仅6％左右。二步法是将酶先用戊二醛处理，形成酶-戊二醛结合物，经过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。酶结合物的质量较均一，产率亦可提高到13％。 戊二醛二步法操作步骤： ①用0．01moL／L、pH6．8PB将25％戊二醛稀释为1．25％； ②称取10mgHRP溶于0．2mil．25％戊二醛，室温(20~C左右)结合18h； ③将反应物通过预先用0．15mol／LNaCl平衡的5ephadexG-50凝胶柱，用平衡液洗脱，去除游离的戊二醛；或对0．01mol／L，pH7．2PBS，4T透析过夜； ④将5mg抗体IeC溶于lan 0．15moL／LNaCl，再与醛化HRP溶液(10mg／an)混合。加入0．1ndlmol／L，pH9．6碳酸盐缓冲液，调节pH至9．0—9．5； ⑤于4~C，电磁搅拌下结合24h。然后加入0．1ml 0，2mol／L赖氨酸(0。29g溶于10ral 蒸馏水)；以封闭残留的醛基，终止反应； ⑥4~C放置2h信装入透析袋，对0．01mol／L、pH7．2PBS，4~C透析过夜；或通过SephadexG-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第l峰洗脱液。加入等量60％甘油防腐，小量分装，4~C或—20~C保存。 (2)改良过碘酸钠法HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠(Nal04)氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成Schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4—二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaBH4)还原成稳定的结合物，见图5—11。 HRP—OH—NalO~HRP—CHO—NH2-IgG，HRP—CH二N—IgC—NaHB％,!HBP—cH2一NH—IgC．图5—11 过碘酸钠标记法反应式 操作步骤 ①取5mgHRP溶于1mL 0．3mol／L，pH8．1 NaHC03，加入1％DNFB无水乙醇溶液0.1mL，室温下轻微搅拌作用Ih； ②加1mL 0．06mol／L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色； ③加1mL 0．16mol／L乙二醇，室温下轻搅1h，终止氧化反应； ④装入透析袋，对0.01mol／L，pH9．5碳酸盐缓冲液1000ml，4℃透析过夜，换液3次；
制备单克隆抗体的技术要点 1．交瘤技术的技术流程 如图4-1所示。 图4 杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本流程2．技术要点 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞
用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合融合是杂交瘤技术的关键一步，细胞融合应在无菌条件下，于室温或37℃水浴中进行。瘤细胞与脾细胞之比为1：8～10，在l～2min内滴加50%PEG 1.0ml 边加边摇，静置1-2min。然后再在2～3min内缓慢滴加无血清培养液，终止反应。1000rpm离心10min。最后加含20%小牛血清的HAT培养液。将细胞混匀，接种于96孔培养板中培养，每孔加0．1ml，同时还加0．1ml的饲养细胞悬液。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA 法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定
(一)酶标抗体的条件 1.纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。 2.特异性强即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。 3.效价高一般琼脂扩散鉴定为1：64以上才算合格。 (二)酶标记方法 1.交联法交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm<3时，即为好的交联剂。 戊二醛交联法又分为一步法和二步法。 (1) 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：①抗IgG-AKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS 液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱);②抗IgG-HRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG 的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。 (2) 二步法：是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作：将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS 中室温放置18h，充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后4℃冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸，置室温2h，以0.15Mol/L