银染步骤及注意事项
银染色步骤为1次固定10分钟冰醋酸2用双蒸水洗涤凝胶，每次1分钟3染色液1g硝酸银。5mL37甲醛1L双蒸水现在匹配染色30分钟。4.快速清洗并清洗凝胶数次。5开发30克碳酸钠1.5毫升37甲醛200微升10毫克/升硫代硫酸钠显影直到出现清晰的条纹银染色成功的关键因素包括:1 .用超纯水，如纳米纯水或Milli-Q或双蒸水进行银染色的纯化2.使用提供的碳酸钠或ACS试剂级碳酸钠染色后用于水洗的时间长度非常重要。清洗胶水，然后将其放入通常浸泡在水中的显色溶液中，只需5-10秒钟。4使用前及时向显色液中加入甲醛和硫代硫酸钠ul/1ml5.使用前及时配制染液银染方法有很多种，目前文献报道有100多种。然而，确切的染色机理还不是特别清楚。一般原理是银离子在碱性酸碱度环境下还原成金属银，沉淀在蛋白质表面形成颜色。银染色广泛用于2D凝胶分析和垂直凝胶，用于极低蛋白质含量的测定，因为它对低于1纳克/蛋白质斑点的染色凝胶具有高灵敏度。本文介绍了我们实验室成功使用的银染色法，以补充关键操作和要求。主要用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测，如内源GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究。银染色程序用于检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。实验原理是在碱性条件下，用甲醛将蛋白质带上的硝酸银和银离子还原成金属银，在蛋白质带上沉积银颗粒。染色程度与蛋白质中某些特殊基团的
有关。不含或很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时会被染色。银染的详细机制尚不十分清楚。试剂乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、
硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或乙二胺四乙酸。Na2.2H2O，甲醛实验程序固定30分钟或更长时间100毫升乙醇40毫升乙醇25毫升冰醋酸10毫升冰醋酸加水250毫升敏化30分钟75毫升乙醇30毫升乙醇17克醋酸钠28.2克三水醋酸钠0.5克硫代硫酸钠加水250毫升水洗涤3×10毫升银染料20分钟0.625克硝酸银100微升37甲醛加水至最终体积250毫升使用前用水冲洗2×1min注意掌握时间水冲洗时间长颜色慢点是黄色发展取决于情况o 6.25 g Na2CO3 o 50 ul 37甲醛添加o 水至最终体积2使用前50ml终止10 min o 3.65 g EDTA、na 2.2h2o 或1g甘氨酸o加水至最终体积250ml保存1冰醋酸4℃注意事项1如果固定时间较长，加一步水洗30分钟以避免胶水太脆而破裂。使用前加入甲醛3最好是第一次再准备一种显色溶液，当溶液变浑浊时，再换成透明的。4 .色彩开发过程中要注意把握时机，避免过度染色5银染色液和显色液需要预冷。6所用的器具应干净，不需要直接接触手，以避免被外来蛋白质污染7洗涤水应尽可能使用高纯度去离子水蒸馏水，这有利于减少背景色。
DNA银染 一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释) 1、固定液：50ml乙醇 2、前处理液（敏化液）：5ml HNO3 3、染色液：0.5g 硝酸银（避光配制） 4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml 5、终止液：50ml 冰醋酸 二、银染步骤（摇床设置52rpm左右） 1、准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中在摇床上轻摇1min； 2、凝胶固定：倒掉盒中的水，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动10min； 3、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次30S； 4、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化6min； 5、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗2次每次10S； 6、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min； 7、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗1次10S； 8、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止； 9、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇2-3min； 10、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次1min。 三、变性聚丙酰胺凝胶的配制（两块、使用1.0BioRad胶板） 1.2%的凝胶可以跑微卫星，和基因组DNA 1、尿素：7.2g 2、30%聚丙酰胺，4.68ml 3、10×TBE，1.5ml (Tris碱108g；硼酸55g；EDTA 40ml 0.5mol/L,Ph=8.0；加水至1L) 4、30%AP，35ul 5、TEMED,4ul 四、下图：左为果蝇正常基因组DNA与损伤后基因组DNA；右为果蝇微卫星电泳 12h Treatment24h Treatment M CT 0 5 10 200 5 10 20 Protein银染 一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释) 1、固定液：200ml甲醇，50ml冰醋酸 2、前处理液（敏化液）：150ml 乙醇，34g醋酸钠，1g硫代硫酸钠（使用前加入） 3、染色液：1.25g 硝酸银（避光配制）
倒闸操作的步骤和注意事项 一、倒闸操作制度及有关规定 1、倒闸操作制度 倒闸操作是一项十分复杂、重要的工作。为了防止误操作事故的发生，保证电力系统的安全生产，经济运行，电气运行人员应严格遵守倒闸操作制度及有关方面的规定。 倒闸操作制度主要强调以下几个方面： （1）、操作指令的发受：属于系统调度管辖的设备，由系统 值班调度员发令操作，且一个操作指令只能由一个值班调度员下达，每次下达操作指令，只能给一个操作任务，只有变电所的副值班员以上的当班人员，才能接受调度的操作指令，同时，必须履行一定的发、受令程序。 （2）、倒闸操作票的填写：倒闸操作前，必须根据调度下达的命令票的要求，按安全规程、现场规程和典型操作票，将操作项目按先后顺序填写成倒闸操作票，按调度命令的项目和顺序逐项操作。 （3）、操作的监护：这是防止误操作事故发生的较后关卡，无论是简单操作或复杂操作，正常操作时都必须有合格的监护人进行监护。操作时，监护人应与操作人一起校对设
备名称和编号，并始终认真监视操作人的每一个动作，发现错误，立即纠正。 2、倒闸操作的有关规定 （1）倒闸操作至少有两人进行，一人操作，一人监护。监护人应由比操作人职务高一级的人员担任，一般可由副值班员操作，正值班员监护。较为复杂的操作由正值班员操作，值班长监护。特别复杂的操作，应由值班长操作，站长或技术负责人监护。 （2）、操作中发生疑问时，应立即停止操作，并向值班长或调度员询问清楚，不得擅自更改操作顺序和内容。 （3）操作中一定要按规定，使用合格的安全用具（如验电器、绝缘棒等），操作人员应穿工作服、绝缘鞋（雨天穿绝缘靴），在高压配电装置上操作时，应戴安全帽。 （4）雷雨时禁止进行倒闸操作。 （5）操作时，操作人员一定要集中精力，严禁边操作边闲谈或做与操作无关的事，非参与操作的其它值班人员，应加强监护，密切注视设备运行情况，做好事故预想，必要时提醒操作人员。 （6）、为避免误操作的发生，除紧急情况及事故处理外，交接班时一般不要安排倒闸操作，条件允许时，重要的操作应尽可能安排在负荷低谷时进行，以减少误操作时对电网的影响。
常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法（主要是银染法）作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。 蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue，CBB）为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差;银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容;荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用;而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一。 我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。 试剂 固相pH梯度干胶条（IPG strip pH3-10NL，IPG strip pH5-8，17cm）、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均为BIO-RAD公司产品。硫酸铵及磷酸均购自成都科龙试剂厂。AgNO3为Sigma公司出品。Protein molecular weight marker #SW0431为MBI公司出品。甲醛、Na2S2O3与Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化工厂产品。 仪器 IPGphor等电聚焦仪、proTEANⅡ垂直电泳仪、Power PAC1000电泳仪、加样溶胀槽、GS-800 Calibrated Densitometer扫描仪、PDQuest凝胶图像分析软件均为BIO-RAD公司产品。 细胞总蛋白质的提取 取4份经常规培养的急性早幼粒白血病细胞株（NB4）1×107细胞各重悬于350 μl蛋白质裂解缓冲液中（8mol/L Urea，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚兰），置冰浴中超声裂解，静置30分钟，15500×g离心30分钟，取上清，进行蛋白质定量。 单向定量电泳 取蛋白质分子量标准物，第一次按1∶2稀释后，以后按1∶3倍比例逐级稀释，经4级稀释后，取15μl 上样液上样，β-半乳糖苷酶上样量依次分别为1μg、0.24μg、0.062μg、0.0156μg、0.004μg。作12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，同时电泳4份胶，显色以确定染色灵敏度。 双向电泳 取300μl样品液沿水化盘中槽的边缘自左向右线性加入，将17cm IPG胶条胶面朝下置于槽中，静置45 分钟后覆盖矿物油，在20℃溶胀11～16小时。溶胀后的胶条置于等电聚焦盘中，在Protean IEF Cell中进行等电聚焦，温度设置为20℃，电压模式设置为：快速升压，250 V，0.5小时;500 V，0.5小时;10000
银染操作步骤 1. 固定： 电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为 60-70rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。 固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100ml固定液，可大量配制室温存放。 2. 30%乙醇洗涤： 弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。30%乙醇的配制：70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇，混匀后即成100ml 30%乙醇。 3. 水洗涤：（洗2次） 弃30%乙醇，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。 4. 增敏：（辅染）现配现用 弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。银染增敏液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1X)。银染增敏液(1X)配制后需在2小时内使用。 银染增敏液(100X)的配制：即2.8%硫代硫酸钠溶液，需用黑袋包裹避光保存。 5. 水洗涤(共2次)： 弃原有溶液，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。 弃水，再加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为 60-70rpm。 6. 银染： 弃水，加入100ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。 银溶液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银溶液(100X)，混匀后即为银溶液(1X)。银溶液(1X)配制后需在2小时内使用，最好是现配现用。 银溶液（100 X）的配制：称取5g硝酸银，加水溶解并稀释至500ml，摇匀即得1%的硝酸银溶液，需用黑袋包裹避光保存。 7. 水洗涤： 弃原有溶液，加入100ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5分钟，摇动速度
核仁组成区嗜银蛋白染色液(AgNOR Stain) 简介: 核仁组成区(NORs)是染色体上的一个编码核糖体RNA(rRNA)的片段，存在于DNA 特异性环上，凸向核仁。硝酸银染色法可确定组织切片上的核仁组成区，可显示与NORs 有关的酸性蛋白。然而，这些银染色NOR 相关蛋白(AgNOR)位点仅代表在每个核仁中的部分核仁组成区，并非全部。在电镜下，核仁组成区为在电子致密区中的境界不清的浅染区域。在石蜡切片上，在核仁中见到的每一个点状反应颗粒有可能代表多个AgNOR 位点，这是因为正常或两性细胞核仁AgNOR 易紧密聚集，所以银染色后，一个点状颗粒实际上是多个AgNOR 的聚集。 核仁组成区嗜银蛋白染色主要特点是操作简便、批量染色的较为经济，AgNOR 位点的数量增加与细胞增殖性增加有关，对于良恶性肿瘤的鉴别具有一定的意义。 组成： 自备材料： 1、10%中性福尔马林固定液 2、显微镜 3、蒸馏水 参考操作(仅供参考)： 1、 切片脱蜡入水，再至蒸馏水。 2、 蒸馏水洗片。 3、 入AgNOR 染色工作液，室温孵育。 4、 蒸馏水洗片。 5、 (可选)甲基绿染色液复染，水洗凉干。 6、 常规脱水，常规透明，非水溶性封片剂封片。 编号 名称 DK0047 2×50ml Storage 试剂(A1): AgNOR 银溶液 25ml 4℃ 避光 试剂(A2): AgNOR 胶溶液 25ml RT 避光 临用前，A1，A2混合，即为AgNOR 染色工作液，即配即用。 试剂(B): 甲基绿染色液 50ml RT 避光 使用说明书 1份
染色结果： AgNOR位点核内黑色点状 背景根据复染液不同而不同 注意事项： 1、组织固定宜采用10%福尔马林或中性福尔马林。 2、本染色液适用于石蜡切片，切片厚度在3～4μ为宜。 3、如需复染，可在步骤4之后用中性红复染，但应注意避免过染。 4、配制好的AgNOR染色工作液易退化，所以最好即配即用，不易久置。 5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效。 相关： 编号名称 DF0111 中性福尔马林固定液(10%) DG0005 糖原PAS染色液 DH0001 改良Lillie-Mayer苏木素染色液 DJ0001 普鲁士蓝染色液(核固红法) PW0053 Western抗体洗脱液(碱性) TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)
ptotocol是这样的，请看哪里不妥： 蛋白银染步骤 步骤溶液时间 固定甲醇100ml 冰醋酸25ml 加双蒸水至250ml 30min 冲洗双蒸水3次 敏化甲醇75ml 戊二醛（25%w/）1.25ml 硫代硫酸钠(5%w/) 10ml 醋酸钠（17g） 加双蒸水至250ml 30min 冲洗双蒸水3次 银反应硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml 甲醛(37%w/) 0.1ml 加双蒸水至250ml 20min 冲洗双蒸水2次 显色碳酸钠(6.25g) 甲醛(37%w/) 0.05ml 加双蒸水至250ml 2-5min 终止EDTA-Na22H2O(3.65g) 加双蒸水至250ml 10min 冲洗双蒸水3次 建议使用silia的方法！！ 简单，快！ 本人的银染方法： 1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20分钟； 2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟； 3. 预处理：0.02％Na2S2O3 处理一分钟； 4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒； 5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟； 6. 水洗：同上； 7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％Na2S2O3, 漂洗10－15分钟； 8. 水洗：同上； 9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。 以上步骤从中科院生化所学来，过程和silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正。谢谢！！！ 5.2.2.3 银染色 1 银染液1（1000ml）：甲醇50％乙酸12％ 甲醇500ml 冰醋酸120ml
穿脱隔离衣 【操作前准备】 1.护士自身准备：衣帽整洁、整齐；修剪指甲、取下手表；卷袖过肘、洗手。 2.用物准备：隔离衣一件，刷手及泡手准备 3.环境准备：清洁、宽敞 【操作步骤】 步骤要点与说明 穿隔离衣 1.取衣手持衣领取下隔离衣，将隔离衣清洁面 朝向自己，污染面向外，衣领两端向外折，对齐肩峰，露出肩袖内口 2.穿衣袖一手持衣领，另一手伸入一侧袖内， 举起手臂，将衣袖穿好；换手持衣领，依上法穿好另一袖 3.系衣领两手持衣领，由前向后理顺领边，扣 上领口 4.扎袖口扣好袖扣或系上袖带，需要时用橡皮 圈束紧袖口 5.系腰带自一侧衣缝腰带下约5cm处将隔离衣 逐渐向前拉，见到衣边捏住，再依法将另一侧衣边捏住。两手在背后将衣边边缘对齐，向一侧折叠，按住折叠处，将腰带在背后交叉，回到前面打一活结系好 脱隔离衣 1.解腰带解开腰带，在前面打一活结 2.解袖口解开袖口，在肘部将部分衣袖塞入工 作衣袖内 3.消毒双手 4.解领口解开领口 5.脱衣袖一手伸入另一侧袖口内，拉下衣袖过 手（遮住手）再用衣袖遮住的手在外面拉下另一衣袖，两手在袖内使袖子对齐，双臂逐渐退出 6.挂衣钩双手持领，将隔离衣两边对齐，挂在 衣钩上；不再穿的隔离衣，脱下后清洁面向外，卷好投入污物袋中当工作服可能被传染性的分泌物、渗出物污染时需要穿隔离衣 隔离衣的衣领和隔离衣内面视为清洁面 取隔离衣时看清隔离衣是否完好、合适，有无穿过；确定清洁面和污染面 系衣领时污染的袖口不可触及衣领、面部和帽子 后侧边缘须对齐，折叠处不能松散 手不可触及隔离衣的内面 如隔离衣后侧下部边缘有衣扣，则扣上 穿好隔离衣后，双臂保持在腰部以上，视线范围内；不得进入清洁区，避免接触清洁物品 如隔离衣后侧下部边缘有衣扣，则先解开 不可使衣袖外侧塞入袖内 消毒手时不能沾湿隔离衣 注意保持衣领清洁 衣袖不可污染手及手臂 双手不可触及隔离衣外面 如为一次性隔离衣，脱时应使清洁面向外，衣领及衣边卷至中央，弃后消毒双手 【注意事项】 1.隔离衣的长短要合适，须全部遮盖工作服，如有破洞，应补好后再穿 2.隔离衣每日更换，如有潮湿或污染，应立即更换 3.穿脱隔离衣过程中避免污染衣领和清洁面，始终保持衣领清洁 4.穿好隔离以后，双臂保持在腰部以上，视线范围内；不得进入清洁区，避免接触清洁物品 5.消毒手时不能沾湿隔离衣，隔离衣也不可触及其他物品 6.脱下的隔离衣如挂在半污染区，清洁面向外；挂在污染区则污染面向外
蛋白质染色（银染法）标准操作规程（编号：041） 1、目的及适用范围 检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质，实验原理是在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。 2、主要仪器 摇床、避光盒 3、试剂及配制方法 乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛，去离子水 固定液：100mL乙醇（40%乙醇），25mL冰醋酸（10%冰醋酸）加水到250mL； 致敏液：75mL 乙醇（30%乙醇）17g 乙酸钠，28.2g 三水乙酸钠（34g乙酸钠），0.5g硫代硫酸钠加水到终体积250mL； 银染液：0.625g AgNO3，100 uL37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250mL； 显色液：6.25 g Na2CO3，50 μL 37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250mL； 终止液：3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸加水到终体积250mL 保存液：1% 冰醋酸 4、操作步骤 4.1固定：50mL固定液中固定30min或者更长时间 4.2致敏：50mL致敏液中致敏30min 4.3水洗：3 x 10min 4.4银染：50mL银染液中染20min （保持避光） 4.5水洗：2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色) 4.6显色：50mL显色液中显色，时间视显色程度而定 4.7终止：50mL终止液中终止10min 4.8保存：1% 冰醋酸，4 ℃ 5、注意事项 88
快速银染试剂盒 产品简介： 快速银染试剂盒(Fast Silver Stain Kit)是一种快速简单、可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白银染的试剂盒。 本试剂盒也可以用于2D凝胶的银染，并且染色后和后续的质谱检测兼容。 本试剂盒只需一小时左右即可观察到蛋白条带，90分钟内可以完成2块凝胶的银染。 对于BSA蛋白，检测灵敏度可以达到0.3ng蛋白。 无需使用有毒的甲醇。 本试剂盒可足够用于25块常规的8×10cm凝胶的银染。 保存条件： 室温保存，一年有效。银溶液(100X)和银染显色加速液(2000X)需避光保存。 注意事项： 由于银染非常灵敏，操作时请注意尽量使用高纯度的水，并确保所使用的器皿非常清洁，最好使用洁净的玻璃器皿。操作时必须戴手套，避免皮肤和凝胶直接接触。 需自备乙醇、乙酸及MilliQ级纯水或双蒸水。 下述使用说明中各种溶液的使用量适用于大小为8×10cm厚度为0.75-1mm的凝胶。对于更大的凝胶，各种溶液的使用量需按凝胶面积的比例放大，对于更厚的凝胶，作用时间需按照厚度的比例适当延长。 本说明书所指的室温为20-25℃，操作温度较低时由于溶液的扩散能力下降，各步骤需适当延长时间。 银染基本显色液(10X)在低温环境下可能会出现沉淀，可在30-37℃水浴中溶解，并充分混匀后使用。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.固定： 电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为60-70rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。 固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100ml固定液。 2.30%乙醇洗涤： 弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。 30%乙醇的配制：70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇，混匀后即成100ml 30%乙醇。 3.水洗涤： 弃30%乙醇，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。 4.增敏： 弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。 银染增敏液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1X)。银染增敏液(1X)配制后需在2小时内使用。 5.水洗涤(共2次)： 弃原有溶液，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。
银染步骤是1 固定10冰乙酸min。2 清洗双蒸水冲洗凝胶次每次1min。3 染色染色液1g硝酸银.5mL37甲醛1L双蒸水。现配染色30min。4 清洗迅速洗凝胶次。 5 显影30g 碳酸钠1.5mL37甲醛200uL 10mg/L硫代硫酸钠。显影至清晰带纹出现。成功银染的关键因素包括 1 用超纯水比如NANOpure或Milli-Q纯化或者是双蒸水作银染。2 用提供的碳酸钠或者ACS试剂级的碳酸钠。3 在染色后水清洗所用时间的长短很重要用不超过5-10秒的时间清洗胶然后放入显色溶液中一般在水里浸一下就好。 4 甲醛和硫代硫酸钠ul/1ml在使用前及时加入到显色液中。 5 在使用前及时配染色液。银染的方法种类很多目前有文献报道的就有100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高可染出胶上低于1 ng/蛋白质点故广泛的用在2D 凝胶分析上及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法对关键操作及要求做了补充主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测如内源性GST-Pulldown、Co-IP 等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验目的检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。实验原理在碱性条件下用甲醛将蛋白带上的硝酸银银离子还原成金属银以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有
关不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还不是非常清楚。试剂乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序固定30min或者更长时间o 100ml 乙醇40 乙醇o 25ml冰醋酸10 冰醋酸o 加水到250ml 致敏30min o 75ml 乙醇30 乙醇o 17g 乙酸钠28.2g 三水乙酸钠o 0.5g硫代硫酸钠o 加水到终体积250ml 水洗3 x 10min 银染20min o 0.625g AgNO3 o 100 ul 37甲醛在使用前加入o 加水到终体积250ml 水洗2 x 1 min 注意把握时间水洗时间长显色速度慢点的颜色偏黄色显色视情况而定o 6.25 g Na2CO3 o 50 ul 37 甲醛在使用前加入o 加水到终体积250ml 终止10min o 3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸o 加水到终体积250ml 保存1 冰醋酸4 ℃注意事项1固定时间较长则加一步水洗30min以免胶太脆而破碎。2甲醛在使用前加入。3 最好多配制一份显色液第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液显色到点清晰。 4 显色过程很快要注意把握时间避免染色过度。5银染液和显色液需要预冷。 6 所用器皿要很洁净不用手直接接触以免杂蛋白污染7 清洗用水尽量用高纯度去离子水蒸馏水更佳可以减少背景着色。
1、开头话语不宜过长，最好直接切入课题，语言应干脆利落。 2、说课过程中尽量脱稿，注意与评委进行目光交流，脸上表情丰富一些，最好面带微笑。 3、说课语言声音宏亮、口齿清楚、使用普通话，不要重复，停顿、迟疑次数不能较多，注意语言的过渡、承转要顺畅，若能做到言简意赅、抑扬顿挫则更好。 4、教材分析要全面、重点突出，如地位和作用、教学目标、重点、难点等应条理清楚，详略得当。 5、教学过程和教材分析、教法与学法各环节应合理分配时间，把握重点，教学过程应略讲。 6、教法和学法设计要体现“学生为中心”的理念，一定要让学生活动起来。教学环节包括复习旧课、引入新课、师生互动、启发思考、迁移类比、重难解析等。教法和学法的设计立意要高，注重培养学生发散思维等能力。 7、板书设计应线索分明、科学新颖、版面布局合理，字号稍大、工整大方、书写速度不宜太慢。 8、布置作业巩固课堂所学知识，若作业能兼有拓展延伸旧知、引入后续新知等功能则更妙。 1、基本素质不错，教案完整、板书设计合理，语言流畅。
2、切入标题应直接，多余废话不说，大标题应板书在黑板中上。 3、啰嗦语言尽量避免，语言要具有亲和力、喜闻乐见、幽默，能体现“寓教于乐”思想最好。说课过程中表述不能出错，引经据典、广泛联系实际时留心遣词造句的细节，如“建构主义”不能说成“构建主义”；说课中若能随口说出一些饱含哲理、寓意深刻的教育教学经典名句则更能令评委感觉耳目一新。 4、教学目标设定应是“三维目标”。 5、板书设计应简洁、工整、大方，板书书写应和说课同步进行，不要等到最好再进行，不要让评委等待看你写板书。 6、说课小结能起到由厚变薄、提纲挈领、画龙点睛之用。 说课基本步骤 今天我说课的课题，准备从四个方面进行：（宜开门见山、直接切题） 一、说教材 1、教材地位分析（强调承前启后、继往开来、宏观把握，说课时语言分段、清晰、适时停顿） 2、教学目标（必须设定三维目标） 3、教材重点和难点（透彻分析教材得出，重点和难点不宜太多） 二、说教法（教学设计思路，说出教学实践、行为的理论依据）
我们实验室用的银染方法 1.50%甲醇浸泡15分钟（置于摇摆床上，以下省略，本步骤两次，每15分钟更换一次） 2.10%甲醇浸泡10分钟 3.水漂洗3次，每次数秒 4.2 gM DTT溶液浸泡20分钟 5.0.1%硝酸银溶液浸泡20分钟 6.水漂洗3次，每次不超过15秒（每次约150ML） 7.显色液漂洗3次，每次不超过15秒（每次约100ML） 8.显色液浸泡显色至看到目的蛋白带（约200ML） 9.10G柠檬酸定影 显色液:15G无水碳酸钠溶于500ml水，用前加入250 g L福尔马林搅拌均匀 水用双蒸水就可以，纯度越高越好，其他试剂用分析纯，据书上说甲醇用化学纯的比分析纯更灵敏 此方法岀自冷泉港蛋白质技术指南（实际上是其蛋白质技术会议的总结）灵敏度稍低于分子克隆上老方法，但是非常方便，也比其他方法快速，只需要1.5小时，我染岀来的胶非常漂亮，有需要的话可以上传给大家看看 一般来说，高背景是由于杂质产生的，银染的水质很重要，最好要用去离子水或双蒸水，装胶的器皿也一定要洗得很干净。固定、银染之后均需充分的漂洗。 其实银染就是银镜反应，可能是你的样品浓度高，所以白了，浓度更高还会变成一条能反光的带。固定时间不需加长，我有时来不及还减少固定时间，银染关键是器皿和溶液干净，显色前胶一定要漂干净 大板本来效果就差点，浓度越大，条带形状越差，这也很正常，银染薄点的胶效果要好些，因为染的是表面的蛋白 1.取下凝胶，蒸馏水冼胶30秒. 2.0.1% 硝酸银染色10分钟. 3.弃去染色液，蒸馏水洗胶1分钟. 4.显色液显色15秒，换用新的显色液，显清条带为止. 显色液配方：10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液，定溶到500ml. 这个染色方法挺好的，我用过.注意染色时间不能长 材料没什么要求，玻璃会更好一点，但不好搞到，我们是见到什么大小合适就用什么。 液体的量一般是胶体积的5倍，比如13X13X 0.1cm的胶，用一百ml 一定够，80也行
操作步骤和注意事项 （一）正置显微镜 1、安放 右手握住镜臂,左手托住镜座,使镜体保持直立.桌面要清洁、平稳,要选择临窗或光线充足的地方.单筒的一般放在左侧,距离桌边3～4厘米处. 2、清洁 检查显微镜是否有毛病,是否清洁,镜身机械部分可用干净软布擦拭.透镜要用擦镜纸擦拭,如有胶或粘污,可用少量二甲苯清洁之. 3、对光 镜筒升至距载物台1～2厘米处,低倍镜对准通光孔.调节光圈和反光镜,光线强时用平面镜,光线弱时用凹面镜,反光镜要用双手转动. 若使用的为带有光源的显微镜,可省去次步骤,但需要调节光亮度的旋钮. 4、安装标本 将玻片放在载物台上,注意有盖玻片的一面一定朝上.用弹簧夹将玻片固定,转动平台移动器的旋钮,使要观察的材料对准通光孔中央. 5、调焦 调焦时,先旋转粗调焦旋钮慢慢降低镜筒,并从侧面仔细观察,直到物镜贴近玻片标本,然后左眼自目镜观察,左手旋转粗调焦旋钮抬升镜筒,直到看清标本物像时停止,再用细调焦旋钮回调清晰. 操作注意：不应在高倍镜下直接调焦；镜筒下降时,应从侧面观察镜筒和标本间的间距；要了解物距的临界值. 若使用双筒显微镜,如观察者双眼视度有差异,可靠视度调节圈调节.另外双筒可相对平移以适应操作者两眼间距. 6、观察 若使用单筒显微镜,两眼自然张开,左眼观察标本,右眼观察记录及绘图,同时左手调节焦距,使物象清晰并移动标本视野.右手记录、绘图. 镜检时应将标本按一定方向移动视野,直至整个标本观察完毕,以便不漏检,不重复. 光强的调节：一般情况下,染色标本光线宜强,无色或未染色标本光线宜弱；低倍镜观察光线宜弱,高倍镜观察光线宜强.除调节反光镜或光源灯以外,虹彩光圈的调节也十分重要. （1）低倍镜观察 观察任何标本时,都必须先使用低倍镜,因为其视野大,易发现目标和确定要观察的部位. （2）高倍镜观察 从低倍镜转至高倍时,只需略微调动细调焦旋钮,即可使物像清晰. 使用高倍镜时切勿使用粗调焦旋钮,否则易压碎盖玻片并损伤镜头. 转动物镜转换器时,不可用手指直接推转物镜,这样容易使物镜的光轴发生偏斜,转换器螺纹受力不均匀而破坏,最后导致转换器就会报废.
D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步 骤 YKK standardization office【 YKK5AB- YKK08- YKK2C- YKK18】
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤 最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂： 1、30％聚丙烯酰胺(29:1) 丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。 2、10％过硫酸胺 过硫酸胺1克，水10ml。 3、TEMED 4、5xTBE Tris 27克，硼酸克， EDTA(pH 10ml，定容至500ml。 二、银染试剂 1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。 2、% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。 3、% NaOH：NaOH 克，水500ml。 4、37％甲醛。 三、配胶(6%)： 30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。室温凝固时间>1小时。 四、银染： 1、固定液固定10m。 2、水洗2m x3次。 3、% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。 4、水洗 20秒x2次。
5、% NaOH 100ml，加37％甲醛，混匀，显色3～10m。 6、水洗若干次，终止显色。 电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。 银染后胶面积将膨胀10％。 在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。 显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。 需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。 下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。 3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。 4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 5. 凝胶显影：
FEI TECNAI 20透射电镜 目录 电镜操作面板...................................... - 2 - 使用步骤：.......................................... - 4 - 一.放置样品 ..................................... - 4 - 二.合轴 ............................................. - 4 - 三.拍形貌 ......................................... - 5 - 四.踩带轴 ......................................... - 6 - 五、拍衍射 ...................................... - 6 - 六、能谱分析 .................................. - 7 - 七、高分辨 ...................................... - 7 - 八、拔样品杆及关机 ...................... - 8 -
电镜操作面板
镜筒 注意事项 1. 使用电镜时，首先要观察电镜的状态。 2. 有黄色背景的按钮，要谨慎。 3. 观察一系列数值，包括：最佳电流值、Spot size 、样品各坐标是否都归零等。
使用步骤： 一.放置样品 1.放样品时，夹子不能碰到银环，放置后，用手振动玻璃管，使样品至中间状态，然后用螺丝帽压紧（不可过紧，固定住即可） 2.插入样品杆时，要使杆上小柱的位置对准左上角螺丝，插至凹槽完全进入，然后连上数据线。确认在双束（双倾台不是双束）下，点两下回车。打开抽真空示意图→Vacuum Overview ，开始抽真空。 3.两次抽真空完毕后，逆时针旋转小柱对准Close ，插入。抽真空共分成两段时间，第二个倒计时结束后，即红灯一灭，必须在20秒内将样品杆逆时旋入。旋入样品杆时，要一手拿着，一手托着，放置进入过快。然后点Tube on 。然后点Col Values Closed 。 检查 4．关灯，取下蒙皮。 5.点击→Search ，即可看到样品所在位置。开始找样品中心空洞。 二.合轴 1.在Spot size 为1，低倍（6200X 或8700X ）下找到薄区（朝着光亮处找）。然后调焦。选择最佳物镜电流值9 2.5854（按Eucentric focus ）。 2.放大倍数至86000X ，然后将光斑移至孔区域，开始合轴。观察光斑是否为圆形，非圆形时要进行调圆→condenser ，调圆后点→ None
基本的银染步骤：（90min） 材料： 超纯水（>18 megohm/cm全程）、塑料染色托盘、摇床、塑料搅拌棒、10mL 一次性管、干净的玻璃杯、量筒、30%乙醇、100%乙醇、固定液（40%乙醇、10%乙酸） 注意事项： 1.在拿胶前确定用去离子水清洗橡胶手套。 2.用干净的容器，并标明银染专用。 3.当摇动时，确保容器大小可使胶在里面自由移动，染色时溶液能完全沫过胶面。 4.在拿胶或换溶液时，避免徒手摸胶或用金属物品接触，及避免对胶施加压力。 5.用有铁氟龙图层的棒和干净的玻璃容器准备试剂。 6.避免试剂交叉污染。 7.用新鲜配置的溶液。 样品含有高浓度的DTT： 如果你的样品含有高浓度的DTT （>50mM）,银染时可能导致条带拖尾和黄色背景。为避免拖尾按照下面的方法还原和烷基化样品： 1. 用新鲜配制的DTT还原你的样品到终浓度为17mM，并在70℃加热10min. 2. 用新鲜配制的碘乙酰胺烷基化你的样品到终浓度为35mM，并在70℃加热10min. 3. 加不含DTT的SDS样品buffer到还原和烷基化后的样品中。进行电泳，并按手册进行银染。 在开始之前： 用试剂盒中的试剂准备如下溶液用于银染： 程序：下面的程序用于8*8厘米预制胶，1.0mm厚。如果要染两块小胶或1.0mm厚的大胶（18*18），保证孵育时间，将所有溶液的体积加倍。 注意：如果你的胶的尺寸和上面提到的不一样，你可能必须通过调整孵育时间和溶液体积来选择银染策略。 所有的孵育应该在一个旋转摇床上进行，以1圈/秒的速度在室温下进行。确保每个胶有100ml的溶液。 1. 电泳后，将胶取出至合适尺寸的银染托盘内，用超纯水简单的清洗一下。 2. 用100ml固定液在摇床上缓慢旋转，固定胶20min。如果你用的是Tricine 胶，那么就固定1小时。 注意：如果没有足够的时间完成银染程序，胶可以在固定液中存放一夜。长时间的固定在某些情况下可能会改善灵敏度和背景。 3. 倒出固定液，用30%乙醇洗胶10min。 4. 倒出乙醇，加入100ml敏化液，孵育10min. 5. 倒出敏化液，100ml 30%乙醇洗胶10min. 6. 用100ml超纯水洗胶10min. 7. 用100ml 染色液孵育胶15min. 8. 染色完成后，倒掉染色液，用100ml 蒸馏水洗胶20-60秒。 注意：如果洗胶超过1min会使银离子减少，影响灵敏度。 9.在100ml 的显影液中孵育胶4-8min，直到条带开始出现，想要的条带强度达到。 10. 当适当的染色强度达到后，立刻加
第一章简介 凝胶电泳是每个做分子生物学的研究者天天都要打交道的基本技术。电泳之后的信息处理与电泳本身同样重要。目前有大量软件可以用于分析电泳结果，要向大家介绍的是Bio-Rad公司的1D凝胶分析软件Quantity One（Bio-Rad还有一个做2D凝胶分析的软件PDQuest）。Quantity One软件是常用1D凝胶分析软件中功能最强大，自动化程度最高的软件。这个软件的最新版本可以在Bio-Rad的网 （https://www.doczj.com/doc/f216188948.html,）免费下载，以供试用或用户升级之用。 Quantity One软件的主要功能包括定量分析(Volumes Quick Guide)，电泳条带分析(Band Analysis)，差显分析(Differential Display Analysis)，克隆计数(Colony Counting Analysis)等，此外，还可以直接控制Bio-Rad公司的各类图像仪和ExQuest自动切胶仪，使您的凝胶分析工作变得极为轻松。 Quantity One软件拥有与windows操作系统下绝大多数应用软件相同的友好界面。 插入密码狗，打开Quantity One软件，可以看到最上缘蓝色横条幅是标题栏，往下依次是菜单栏和工具栏。 File 图像打开、保存、引入、打印等操作 Ma tch 分子量估算、条带匹配分析 Edit 图像普通编辑操作Vo lumn 定量分析 View 图像缩放、三维视图、看光密度值等操作 An alysis 浓度估算、克隆计数等分析
每个菜单的主要功能如下： 往 下一行是工具栏，上面每个按钮的功能见下表： Quantity One 软件Help àQuick Guide 快捷指南提示如何实现一个功能，如定量分析(Volumes Quick Guide)，电泳条带分析(Band Analysis)，差显分析(Differential Display Analysis)，克隆计数(Colony Counting Analysis)等。快捷指南下有1，2，3…步骤，根据提示完成。 使用Quantity One 软件进行电泳结果分析，通常包括图像获取、图像预处理、分析、结果输出四部分。图像获取就是通过软件控制扫描仪（GS-800、PharosFX 等）或凝胶成像系统（GelDoc 、ChemiDoc 、VersaDoc 等），图像预处理就是将扫描或拍照获得的原始图像进行初步处理，以便更好地进行后续分析。接下来是分析过程，根据分析的方法和目的不同，又可以分为定量分析、条带分析、克隆计数、差异（聚类）分析等等。不管如何分析，最终我们都必须通过软件的输出功能，得到我们想要的结果。Quantity One 软件提供了多种结果输出方式。在接下来的几章里，我们将按照这个思路，一步步引导您使用这一软件。 Imag e 图像旋转、翻转、裁切等操作 Re ports 分析结果输出 Lane 泳道分析 Wi ndow 窗口分析 Band 条带分析 He lp 帮助、快捷菜单、软件注册等
自己染发的步骤及注意事项 在“3·15”消费者权益日即将到来之际，市卫生局组织执法人员对全市染发剂生产企业依法进行了为期一周的执法检查。针对检查情况，市卫生局日前发布健康警示，提醒消费者自己染发要选择天然染发剂。 随着社会经济发展和人民生活水平提高，染发已经为越来越多的人所接受，尤其是在青年、中老年人群中消费需求很大。值得注意的是，染发剂质量的好坏与消费者健康密切相关。 市卫生局提醒广大消费者，自己在选购使用染发剂染发时应注意下列事项： 一、识别包装标识。标签上应当注有产品名称、厂名、卫生许可证编号、批准文号；小包装或者说明书上应当注有生产日期、有效使用期限、使用方法和注意事项；标签、小包装或者说明书上不得注有适应症，不得宣传疗效，不得使用医疗术语。 二、少用永久性染发剂的化学染发膏。例如一洗黑、一梳黑等混合在一起使用的快速上色的染发膏。
三、切记染发禁忌症。有疮疖、皮肤溃疡的人，不宜染发。 陶博士天然染发剂是纯植物成份，不含任何致敏致癌的化学物质，是适合自己染发最好的天然染发剂。陶博士天然染发剂染发操作简单，更能享受自己染发带给我们的成就感。 自己染发的一般步骤 操作前准备： 自己染发时，使用非焗油型洗发水清洁头发表层的油污（记住，一定要是不含焗油成分的洗发水哦。因为焗油成分会附在发丝表面形成保护膜，导致黑色植物精华比较难渗透），再用毛巾擦干至6-7成干，这样有利于植物黑发素的渗透，提高黑发效果。 两步操作： 第一步：用梳将第一剂（1剂植物黑发精华）染发剂涂至头发，根据头发长短决定用量，用梳子正反方向反复梳理均匀，戴上浴帽用加热帽加热10分钟后关掉开关保温状态加热20-30分钟。对多年没染发的纯白干枯发质，可适当延长加热时间。然后用清水简单清洗，用毛巾擦至不滴水（注意：在清水的时候不要清洗过度，稍微用水简单清洗一下头发的表皮层即可，