根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素： IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱） 其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 II 型干扰素：干扰素γ（IFN ) 来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）
2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。 免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。 ●对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达 增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc 受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。 ●对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂 量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。 ●对其它细胞的作用：IFNγ对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性 粒细胞，增强其吞噬能力；②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；
附录ⅩC 干扰素生物学活性测定法 第2法报告基因法（适用于Ⅰ型干扰素） 本法系将含有干扰素刺激反应元件和荧光素酶基因的质粒转染到HEK293细胞中，构建细胞系HEK293puroISRE-Luc，作为生物学活性测定细胞，当Ⅰ型干扰素与细胞膜上的受体结合后，通过信号转导，激活干扰素刺激反应元件，启动荧光素酶的表达，表达量与干扰素的生物学活性成正相关，加入细胞裂解液和荧光素酶底物后，测定其发光强度，，得到标准品溶液生物学活性对其化学发光强度的剂量反应曲线，以此测定Ⅰ型干扰素生物学活性。 试剂（1）完全培养液MEM培养液，含有2mM的L-谷氨酰胺，1mM的丙酮酸钠，0.01mg/L的非必需氨基酸，2μg/ml的嘌呤霉素，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素，10%的胎牛血清。4℃保存。 （2）测定培养液除不含嘌呤霉素外，其它成分与完全培养液相同。4℃保存。 （3）PBS 取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。 （4）消化液称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、胰酶2.5g，用PBS溶解并稀释至1000ml，除菌过滤。4℃保存。 （5）荧光素酶报告基因检测试剂盒包括细胞裂解液、荧光素酶底物等。 标准品溶液的制备取重组人干扰素生物学活性测定国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1ml约含10000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。 供试品溶液的制备将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每1ml约含10000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。 测定法使HEK293puroISRE-Luc细胞在完全培养液中贴壁生长。按1∶4传代，每周2～3次，于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗1次后消化和收集细胞，用测定培养液配制成每1ml含3.5×105～4.5×105个细胞的细胞悬液。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入可用于细胞培养和化学发光酶标仪测定的96孔细胞培养板中，每孔加入100μl，然后将上述细胞悬液接种于同一96孔细胞培养板中，每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养18～24小时。小心吸净96孔细胞培养板中的上清液，按荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书加入细胞裂解液和荧光素酶底物，用化学发光酶标仪进行测定发光强度，记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果： D s× E s 供试品生物学活性（IU/ml）=P r×------------ D r× E r 式中P r为标准品生物学活性，IU/ml； D s为供试品预稀释倍数； D r为标准品预稀释倍数； E s为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数； E r为标准品半效稀释倍数。
髓系细胞中C9orf72抑制STING诱导的炎症 导读 肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)在临床表现、病理和遗传有很多共同点，并且这两种疾病种也都伴随着自身免疫性紊乱。C9orf72基因突变导致蛋白表达降低，大脑和外周血细胞重复突变的RNA和双肽增加累积。本研究完全敲除了小鼠髓系细胞中的C9orf72，进而发现小鼠表现出年龄依赖性淋巴细胞肥大和自身炎症，从C9orf72?/?小鼠中分离出来的树突状细胞显示I型干扰素反应早期激活，而C9orf72?/?髓系细胞对干扰素基因(STING)蛋白刺激因子过度激活，同时自身溶酶体途径对STING的降解减弱，激活了C9orf72?/?免疫细胞中的I型干扰素反应，造成了脾肿大和炎症。此外，还发现缺少一个或两个C9orf72基因拷贝的小鼠更容易患自身免疫性脑炎，这与C9-ALS/FTD患者对自身免疫性病的易感性相似，通过STING抑制剂可以降低I型干扰素。结果表明，C9-ALS/FTD患者由于C9orf72蛋白水平降低无法抑制由STING介导的I型干扰素炎症反应最终导致免疫失调。 实验设计 结果 1 C9orf72敲除小鼠免疫状态改变 C9orf72敲除小鼠表现出淋巴器官增生和年龄相关性全身炎症。研究者发现C9orf72?/?小鼠在8周时出现有轻微炎症和淋巴样增生，在8个月时出现明显的全身炎症。DC亚型在C9orf72?/?小鼠中发育正常，随着年龄的增长CD11b DC细胞上共刺激分子CD86的表达增加（图1. a, b）。C9orf72?/?小鼠胸腺中的T细胞发育正常，但是记忆和效应记忆CD4和CD8 T细胞的数量甚至在8周时就增加了，并且随着年龄的增长变得更加明显(图1.c, d)。 考虑到C9orf72在淋巴细胞中表达水平较低，研究者将C9orf72f l/f l小鼠分别与Cx3cr1C re 和LysM Cre小鼠进行杂交，以确定其髓系细胞的特有表型。C9orf72fl/fl小鼠体内中髓系群体(包括
基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用 一、课程设计目的 了解工业生产中的新型育种技术并比较不同育种技术的优势； 学习理解基因工程育种技术及其操作原理； 研究基因工程育种技术在人干扰素生产中的创新。 二、课程设计题目描述与要求 本文介绍一种二十世纪七十年代发展起来的一种新型生物技术——基因工程，介绍其在育种中的应用。文中重点介绍了基因工程育种的一般步骤，以及近年来出现的运用基因工程进行定向育种的主要新技术：基因的定点突变，易错PCR，DAN重排及基因组重排。之后，应用基因工程育种技术重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素a2b, 通过优化补料分批培养时葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表达量和表达速率。不同的葡萄糖流加方式有各自的优点,采用恒速流加葡萄糖的方式,hIFNa2b的表达量达到6 540 mg/L,高于目前已知文献中hIFNa2b的最高表达量5 200 mg/L。
三、课程设计报告内容 引言 基因工程是二十世纪七十年代发展起来的一种新型生物技术，其发展从根本上改变了生物技术的研究和开发应用模式。1972年美国的Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV 40DNA、λ噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦佛大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素连个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。在二十世纪八十年代以来，随着大批大批成果的出现及应用，基因工程带来了一场新的革命。 利用这些技术，可以直接地、有针对性地在DNA分子水平上改造生物的遗传性状。通过转入外源基因，微生物和动、植物细胞可以产生出自身原来没有的蛋白质。同样，利用重组DNA技术，也可以使一些原来存在量极低但有重要工业或医学用途的小分子(抗生素)或蛋白质之外的大分子物质得以大量生产。特别是随着重组DNA技术的完善和发展，以基因水平为核心的现代分子定向育种技术越来越受到工业微生物育种学家的关注，并展示了良好的应用前景。 1、基因工程育种 基因工程育种是在基因水平上，运用人为方法将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一细胞，使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达引，与前几种育种技术相比，基因工程育种技术是人们在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先设计和控制的育种新技术，它可实现超远缘杂交，因而是最新最有前途的一种育种新技术。基因工程技术的全部过程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细胞和目标基因的表达等主要环节。 1.1 基因工程育种的一般步骤是： (1)目的基因的获得：一般通过化学合成法、物理化学法(包括密度梯度离心法、单链酶法、分子杂交法)、鸟枪无性繁殖法、酶促合成法(逆转录法)、Norther
干扰素介导的信号转导 学院：生命科学学院 专业：发育生物学 姓名：刘彩云 导师：张立 学号：2011211019 联系方式：liucaiyun121320@https://www.doczj.com/doc/f913202200.html,
干扰素介导的信号转导 摘要:IFN-α／β是一类重要的细胞因子,在体内外可介导多种生物学活性,包括 抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。近来研究表明, IFN-α／β与细胞表面的特异 性受体结合,除了诱导经典的JAK-STAT途径外,还能诱导IRF途径、p38MAPK 途径、IRS-PI3K 途径、CrKL途径等。而且不同的信号途径有一定的交互反应。明 确各种信号传导途径及其介导的生物学效应,有助于了解IFN的作用机制,本文 综述了IFN-α／β发挥其生物学效应所历经的不同信号转导途径。 关键词：IFN-α／β，细胞因子，信号途径 1.前言 干扰素（interferon,IFN）是细胞对相关刺激反应时所产生的细胞信号蛋白质，是细胞因子超家族中一个糖蛋白类同源细胞因子家族，称为IFN家族。已鉴 定出该家族中的3个主要成员：IFN-α、IFN-β和IFN-γ[1]。干扰素通过不同 的信号传导通路发挥不同的生物活性, 其中Ⅰ型干扰素通过含JAK-STAT, MAPK-p38 和 PI3K 这 3 条通路发挥抗病毒、抗细胞增殖及免疫调节等重要作用, 而Ⅱ型干扰素则通过 JAK-STAT 和 MAPK-p38 路径发挥生物学作用, Ⅲ型干扰 素则仅通过 PI3K 通路发挥生物学作用; 这 3 条传导通路包含 98 个基因和 19 693 个 SNPs, 组成了复杂的基因间相互作用网络[2]。近期研究表明，IFN-α 与其受体结合后，可激活多种信号转导途径，从而发挥其抗病毒、抗肿瘤（抗增殖）及免疫调节等多种生物学功能。本文综述IFN-α／β发挥其生物学效应所 历经的不同信号转导途径及其信号转导分子的近期研究进展。 IFN-α／β及其受体 IFN和靶细胞上的受体结合介导其生物学效应。IFN-α、IFN-β共用一个受 体即IFNAR,它由IFNARⅠ和IFNARⅡ两个亚单位组成。IFNARⅡ有两种剪接体,一 种较短,由331个氨基酸组成,命名为IFNAR2b;另一种较长,由515个氨基酸组成, 命名为IFNAR2c。IFNAR2b只含26 个氨基酸,不能传导信号,而IFNAR2c胞内区 较长,由251个氨基酸组成,可传导信号。IFNARⅠ和IFNARⅡ的胞内区无酶活性,
1 JAK-STAT 信号通路 1) JAK 与STAT 蛋白 JAK-STAT 信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。 (1) 酪氨酸激酶相关受体( tyrosine kinase associated receptor ) 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT 信号通路来传导信号，这包括白介素2?7 (IL-2?7 )、GM-CSF (粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)、GH (生长激素)、EGF (表皮生长因子)、PDGF (血小板衍生因子)以及IFN (干扰素)等等。这些细胞 因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK 的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK 的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶JAK ( Janus kinase ) 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体( receptor tyrosine kinase, RTK )，而JAK 却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK 是英文Janus kinase 的缩写，Janus 在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定 SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域(JAK homology domain, JH )，其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3) 转录因子STAT ( signal transducer and activator of transcription ) STAT 被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性 的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具 有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“ GTFLLRFSS ”。 2) JAK-STAT 信号通路 与其它信号通路相比，JAK-STAT 信号通路的传递过程相对简单。信号传递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残 基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位
synergistic and antagonistic effects（协同作用和干扰作用） innate and adaptive immunity（先天性和适应性免疫） antiviral agent （抗病毒剂） 一、干扰素分类： 基于与IFNs的结构特征、细胞来源、受体类型以及生物活性，将IFNs分为三种。 1.结构特征： 所有I型IFN组分缺乏内含子，并且聚集在小鼠基因组的4号染色体上，人的染色体9的短臂上。（以单体形式起作用） Ⅱ型干扰素基因具有3个内含子，并且聚集在小鼠基因组的10号染色体上，人的染色体12的长臂上。（以同型二聚体的形式起作用） Ⅲ型干扰素聚集在小鼠基因组的7号染色体上，人的染色体9的上。 2.细胞来源： I型IFN： IFN-α是由造血细胞，特别是浆细胞样细胞、树突状细胞产生的。（而书上说所有细胞均能产生多种） IFN-β是由大多数细胞产生的。（而书上说它是由成纤维细胞产生的） Ⅱ型IFN： IFN -γ主要由T淋巴细胞（主要），天然杀伤细胞和抗原呈递细胞（APC）如单核细胞，巨噬细胞和树突状细胞分泌（在早期宿主细胞感染过程中）。3.受体类型 IFN也是II类细胞因子中的一部分，其他包括6个IL-10相关细胞因子：IL-10，IL-19，IL-20，IL-22，IL-24，和IL-26 以及几种病毒IL-10相关的细胞因子。II类细胞因子都通过在其细胞外结构域中共享共同基序的受体信号，并且表示为II类细胞因子受体家族（CRF2）。 I型IFN受体： 二聚体受体复合物：IFN-α受体1（IFNAR1）和IFN-α受体2（IFNAR2）。II型IFN受体： 两亚基组成的细胞表面受体结合：IFNGR1和IFNGR2。 III型IFN受体： 两个亚基组成的IFN-1受体（IFN1R）：IFN1R1（IL28Rα）和IL10Rβ。 4.生物活性： Ⅰ型干扰素最显著的作用是 （1）抗病毒和抗细胞增殖； （2）调节天然免疫，增强NK细胞和T细胞的毒性； （3）激活适应性免疫系统； （4）在被感染了的细胞及其相邻细胞中诱导产生一种细胞内在的抗微生物
干扰素a-2b与a-2a的区别 干扰素是人和动物细胞受到合适的刺激时产生的一种微量的、具有高度生物学活性的糖蛋白，一般分为I型和Ⅱ型。Ⅰ型干扰素包括α-IFN和β-IFN是由白细胞和成纤维细胞产生，Ⅱ型干扰素，又称γ-IFN或免疫干扰素是由有丝分裂原刺激T淋巴细胞产生。 IFN-α是人体抵抗病毒和细菌侵袭的重要蛋白质，当人体受到病毒感染时，机体内就会产生大量的干扰素。当你得流感时，你就会感受到干扰素的存在，感冒时的发烧、关节痛、全身肌肉酸痛症状就是由于流感病毒感染后，体内产生了大量干扰素蛋白质引起的。IFN-α按氨基酸序列的不同，IFN-α可分为a-1b、a-2a、a-2b等。 临床上用于治疗乙肝和丙肝的干扰素都是基因工程生产的干扰素蛋白质。我们谈干扰素a-2b与a-2a的区别时，指的是两种蛋白质的区别。 干扰素a-2b和干扰素a-2a是干扰素a的两种类型，分别由干扰素a-2b 基因和干扰素a-2a基因产生。干扰素a-2b与a-2a蛋白的不同，根本上，是由于两种干扰素的基因不同。研究表明，干扰素a-2b基因是我们人类本身就有的基因，通过对15000人的干扰素基因分析后发现，人体内没有找到干扰素a-2a基因，这就意味着干扰素a-2b蛋白质是我们人类本来就有的“天然干扰素”，而干扰素a-2a是人本来没有的，是“外来的蛋白质”。 这种基因上的差别有什么意义呢？我们知道，免疫系统最重要功能就是区分什么是“自我的”，什么是“外来的”。当免疫系统认为是自我的蛋白质时，
不进行攻击，相安无事；但是当免疫功能认为是“外来”的蛋白质时，就会把它当做敌人发起攻击，动员免疫细胞，产生出抗体去中和“外来的蛋白质”。干扰素a-2b基因是人本来就有的基因，治疗乙肝时，当干扰素a-2b蛋白（如Intron A，甘乐能）注射入人体后，人体认为是“自我”的蛋白，不会产生中和抗体进行中和；与此相反，由于人本来没有干扰素a-2a基因，当干扰素a-2a被注射入人体后，免疫系统会认为干扰素a-2a是“外来”的蛋白质，从而发动攻击，结果产生“中和抗体”，对体内的干扰素a-2a蛋白进行结合和中和，导致治疗无效或治疗一段时间有效后疾病再次复发。 蛋白质由氨基酸组成，多个氨基酸连接起来就成为蛋白质。如果把氨基酸比做一个一个珍珠，那么蛋白质可以简单地比喻为一串珍珠项链。下面我们看看干扰素a-2b与a-2a的这两串珍珠项链有什么区别。两种干扰素都有165个氨基酸，只有第23位氨基酸不同，干扰素a-2a的第23位是精氨酸，用R表示，干扰素a-2b的第23位是赖氨酸，用K表示。 如果把组成干扰素的氨基酸比做是一个一个字母，那么，干扰素a-2b 与a-2a的区别就只有“一字之差”。但就这“一字这差”，决定了一个是“自我” 的“天然干扰素”，一个是“外来”的干扰素蛋白质。临床应用时，干扰素a-2b 治疗时的中和抗体发生率较低，约6%，而干扰素a-2a的中和抗体发生率高达25%。治疗慢性乙肝或慢性粒细胞白血病时，由于中和抗体的产生，干扰素a-2a的无效或复发率要稍高于干扰素a-2b。
I 型干扰素诱导的信号通路 一、背景 人体在受到病原物感染后， 会激活自身的免疫调节系统 一先天免疫和后天免疫， 来抑制 病毒的入侵和复制。免疫系统会释放一系列细胞因子抵御病原物入侵， 其中对抵御病毒最有 效的就是干扰素(interferon , IFN)。干扰素是一种细胞因子蛋白， 能够激活人体免疫细胞 (如巨噬细胞和天然杀伤细胞)，有效的干扰病毒复制，增强宿主的防御力。受感染的细胞 会释放干扰素，保护宿主细胞免受病毒、寄生虫、细菌等多种病原体的侵袭。在临床治疗中， 重组人干扰素广泛用于治疗乙肝、丙肝、 单纯疱疹、多发性硬化和多种病毒引起的癌症。 目 前，人类发现的干扰素种类已超过了 20种，它们可以分成三大类：I 型干扰素，II 型干扰 素和III 型干扰素。干扰素 a 和干扰素B 是两种典型的I 型干扰素，人类和大多数动物体 内都发现了它们的存在，并且主要产生于病毒感染后的先天免疫反应中。本文主要讨论 I 型干扰素在人体内触发的信号通路。 I 型干扰素在免疫细胞中的产生是由于宿主细胞内的模式识别受体(pattern recognition receptor , PRR 对病原体特殊成分的识别引起的。目前的研究发现，主要有 四种途径会诱导I 型干扰素的产生：DNA 病毒激活第二信使 cGAMP( cyclic GMP-AMP )诱导 途径；RNA 病毒激活 RLRs( RIG-I-like receptors )诱导途径；TLR3 和 TLR4 ( Toll-like receptors )激活适配蛋白TRIF 诱导途径；TLR7/TLR8和TLR9激活转录因子IRF7诱导途径。 I 型干扰素产生后，通过与干扰素受体结合引发进一步的抗病毒反应。 二、I 型干扰素受体 I 型干扰素a 和B 的分子有序列同源性，功能类似，并共用相同的细胞表面受体。 I 型 IRF9 EIF4E i 卄;： 中国科学: 生命科学 2015年 第45卷 第2期: 142 ~ 155 SCIENTIA SINICA Vitae https://www.doczj.com/doc/f913202200.html, https://www.doczj.com/doc/f913202200.html, 引用格式: 徐刚, 刘实, 朱应. Ⅲ型干扰素最新研究进展. 中国科学: 生命科学, 2015, 45: 142–155 Xu G, Liu S, Zhu Y. Complicated, critical and elusive role of IFN-λ. SCIENTIA SINICA Vitae, 2015, 45: 142–155, doi: 10.1360/N052014-00298 《中国科学》杂志社 SCIENCE CHINA PRESS 中国知名大学及研究院所专栏 武汉大学专题 评 述 Ⅲ型干扰素最新研究进展 徐刚, 刘实, 朱应* 武汉大学生命科学学院, 病毒学国家重点实验室, 武汉 430072 * 联系人, E-mail: yingzhu@https://www.doczj.com/doc/f913202200.html, 收稿日期: 2014-10-12; 接受日期: 2014-11-16; 网络版发表日期: 2015-02-03 国家自然科学基金(批准号: 81461130019)资助项目 doi: 10.1360/N052014-00298 摘要 IFN-λ是新发现的分类为Ⅲ型干扰素的细胞因子, 由IFN-λ1, IFN-λ2和IFN-λ3组成, 也称作IL29, IL28A 和IL28B. IFN-λ通过与其受体复合物结合进行信号转导, 该复合物由特异性的IFN-λR1以及与IL-10相关的细胞因子共有的受体IL-10R2组成. IFN-λ主要激活Jak-STAT 通路诱导抗病毒、抗增殖、抗癌以及先天或适应性免疫反应. 其晶体结构与IL-10细胞因子家族相似. 诱导IFN-λ基因表达的通路尚未被研究透彻, 在一定程度上同IFN-α类似, 涉及TRIF, RIG-I 或IRF7通路. IL28B 的核苷酸多态性与丙型肝炎病毒(HCV)的自发性清除及HCV 联合疗法的结果有关联, 预示IFN-λ可以作为替代目前IFN-α治疗HCV 感染的一个更有效的选择. 本文提供了IFN-λ的一些研究进展, 关于IFN-λ的很多机制目前仍是未知的. 关键词 IFN-λ 信号通路 抗病毒 单核苷酸多态性 IFN-λ(interferon-λ)是在2003年被2个独立的研究组共同发现的一种新的Ⅲ类细胞因子家族, 由IFN-λ1, IFN-λ2和IFN-λ3(也称白介素29(interleukin 29, IL29)、白介素28A(IL28A)和白介素28B(IL28B))组成[1,2]. IFN-λ现在统称为Ⅲ型干扰素, 根据其结构特征、受体及生物学功能同Ⅰ型和Ⅱ型干扰素区分 开[3]. 它们利用一个独特的由IFN-λR1(CRF2-12 (cytokine receptor family 2 member 12))和IL-10R2 (CRF2-4)形成的异二聚体受体复合物, 通过Jak-STAT(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription)信号通路来进行信号转导, 发挥其生物学功能[4]. IFN-λR1主要存在于上皮组织的细胞, 如角质形成细胞、支气管上皮细胞和肝细胞, 一些免疫细胞也可以产生IFN-λR1; 而IL-10R2则在很多细胞中表达, 同时也是IL-10, IL-22和IL-26受体复合物 的重要组分[2,5,6]. Lind 等人[7]的研究揭示了人类胰岛中Ⅲ型干扰素受体IFN-λR1的表达, 从而为IFN-λ调节胰岛的柯萨奇病毒感染提供了基础, 从某方面说明, 未知的IFN-λR1表达的细胞类型可能是因为很多细胞类型并没有被研究而未被发现. IFN-λ也在相对有限的细胞类型中产生, 主要由先天免疫细胞产生, 如树突状细胞[8,9]、巨噬细胞; 也可以在非免疫细胞中产生, 如上皮细胞[10,11]. IFN-λ主要作用是诱导抗病毒、抗增殖、抗癌和免疫反应[2,12]. 1 IFN-λ和IFN-λR1晶体结构 IFN-λ典型的拓扑学结构特征是由A~F 6个螺旋组成, 6个螺旋以不同长度的环相连接, 其中A, C, D, F 形成一个标准的上-上-下-下四螺旋束(图1), 组成 冻干基因工程α1b干扰素使用说明书 本品系用健康人白细胞中获得的α1b干扰素基因组建杂交质粒，转化大肠杆菌，使之高效表达人α1b干扰素，经高度纯化后冻干制成。本品为微黄色疏松体，每支含α1b干扰素10μg、20μg或30μg，相当于用MDBK/EMC系统测定的效价100万单位，200万单位和300万单位，用于慢性乙型肝炎、丙型肝炎及毛细胞白血病的治疗。 用法 每支用灭菌注射用水1ml溶解，肌内或皮下注射，不得静脉注射，建议晚上给药。剂量及疗程推荐如下： 毛细胞白血病：40～60μg，每天注射一次，连续用药6个月以上。可根据病情适当调整，缓解后可改为隔天注射1次。 慢性乙型肝炎：40μg（20～60μg），每天注射一次，或在用药4周后改为每周3次，连续治疗3个月或更长。 副反应 最常见的副反应为发热和疲劳，常在开始用药阶段出现，多数为低热（38℃以下），一般为一过性。其他副反应有头痛、肌痛、关节痛、食欲不振、恶心等。 常见的化验异常是颗粒白细胞减少和血小板减少，停药后可恢复。 如出现上述患者不能忍受的严重副反应，应减少剂量或停药，并进行对症治疗。 禁忌证 1.已知对干扰素制品过敏者； 2.有心绞痛、心肌梗塞病史以及其他严重心血管病史者； 3.有其他严重疾病，不能耐受本品之副反应者； 4.癫痫和其他中枢神经系统功能紊乱者。 注意事项 1.凡有明显过敏体质，特别是对抗生素有过敏者，本品应慎用，必须使用时应先用本品作皮肤试验（1:100稀释，皮内注射），阴性者方可使用。在使用过程中如发生过敏反应应立即停药，并给予相应治疗。 2.使用前应仔细检查安瓿，如安瓿有裂缝、破损不可使用。在加入灭菌注射用水后稍加振荡，制品应溶解良好，如有不能溶解的块状或絮状物，不可使用。 3.制品溶解后应一次用完，不得分次使用。 https://www.doczj.com/doc/f913202200.html, I型干扰素诱导的信号通路 一、背景 人体在受到病原物感染后，会激活自身的免疫调节系统—先天免疫和后天免疫，来抑制病毒的入侵和复制。免疫系统会释放一系列细胞因子抵御病原物入侵，其中对抵御病毒最有效的就是干扰素（interferon，IFN）。干扰素是一种细胞因子蛋白，能够激活人体免疫细胞（如巨噬细胞和天然杀伤细胞），有效的干扰病毒复制，增强宿主的防御力。受感染的细胞会释放干扰素，保护宿主细胞免受病毒、寄生虫、细菌等多种病原体的侵袭。在临床治疗中，重组人干扰素广泛用于治疗乙肝、丙肝、单纯疱疹、多发性硬化和多种病毒引起的癌症。目前，人类发现的干扰素种类已超过了20种，它们可以分成三大类：I型干扰素，II型干扰素和III 型干扰素。干扰素α和干扰素β是两种典型的I型干扰素，人类和大多数动物体内都发现了它们的存在，并且主要产生于病毒感染后的先天免疫反应中。本文主要讨论I型干扰素在人体内触发的信号通路。 I型干扰素在免疫细胞中的产生是由于宿主细胞内的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）对病原体特殊成分的识别引起的。目前的研究发现，主要有四种途径会诱导I型干扰素的产生：DNA病毒激活第二信使cGAMP（cyclic GMP-AMP）诱导途径；RNA病毒激活RLRs（RIG-I-like receptors）诱导途径；TLR3和TLR4（Toll-like receptors）激活适配蛋白TRIF诱导途径；TLR7/TLR8和TLR9激活转录因子IRF7诱导途径。I型干扰素产生后，通过与干扰素受体结合引发进一步的抗病毒反应。 二、I型干扰素受体 浅谈基因工程药物 基因工程药物是指用现代基因重组高科技对基因进行克隆，通过重组DNA导入大肠杆菌、酵母或动物细胞成功构建工程菌株或细胞株，在工程菌株、细胞中所表达生产的新型药物包括细胞因子、多肽类激素、溶血栓药物、疫苗、抗体、反义RNA及基因治疗药物等等多种难治疾病的基因工程药物. 基因工程药物因其疗效好、应用范围广泛、副作用小的特点成为新药研究开发的新宠。也是发展最迅速和最活跃的领域。自1982年美国Lilly公司上市了第一个基因工程产品——人胰岛素以来，至今已有基因工程药物大约140多种上市，尚处于临床试验或申报阶段的基因工程药物有500多种。当传统制药业的增长速度减慢时，基因工程制药正在加速发展，全世界基因工程药物持续6年销售额增长率都在l5％～33％，基因工程制药已成为制药业的一个新亮点[1-2]。 一.目前药物治疗的主要类型 1.胰岛素至今仍是临床上治疗糖尿病最有效的方法。 过去，胰岛素主要从猪等大家畜胰腺中提取。从一头猪的胰腺中只能提取出300单位胰岛素，而一个病人每天就需要40单位胰岛素，因此远远不能满足需要。 基因工程技术一问世，科学家就想到利用该技术来解决胰岛素药源不足的问题。他们首先要找到胰岛素基因，在人的胰岛细胞里有一段特定结构的DNA 分子指挥着胰岛素的合成，然后又找到在人的大肠里存在对人体无害的大肠杆菌。把人的胰岛素基因转入到大肠杆菌的细胞中，随着大肠杆菌的繁殖，胰岛素基因也一代代的遗传下去。大肠杆菌繁殖速度相当快，大约20分钟就能繁殖一代，把它放到大型的发酵罐里进行人工培养，就可以大量繁殖，并且生产出大量人的胰岛素。 1981年，基因重组人胰岛素产品正式投入市场，大肠杆菌成了名副其实的生产胰岛素的“活工厂”，胰岛素供不应求的问题彻底解决了 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素!大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题 2.干扰素： 是哺乳动物细胞在诱导下产生的一种淋巴因子，能够加强巨噬细胞的吞噬作用和对癌细胞的杀伤作用，抑制病毒在细胞内的增殖，用于肿瘤和其他病毒病的治疗。基因工程干扰素干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”!过去从人血中提取， 对已知基因序列的干扰素 , 基因文库的调用可以用其序列 3' 端和 5' 端部分事先用同位素 标记过的序列作为探针 , 通过杂交的方法进行调用。由于干扰素基因的种属特异性不是很大 ,| 可以用人的干扰素基因为同源探针 , 从鼠基因文库中调出相应的干扰素基因 , 其方法将在下文 1 中提到。 | 对于扰素基因的取用 , 不仅可以使用构建基因文库的方法 , 对已了 解其氨基酸或核昔酸割 成的干扰素也可以用化学合成的方法先合成其编码的 DNA 序列 , 再 对其进行表达。化学合 | 成方法包括固相合成法及液相合成法两大类。与利用基因文库的方法相比 , 化学合成法比较 | 复杂 , 由于每加入一个核昔酸就会有一定比例的错误掺入、基因重叠、基因缺失等情况 , 并且在 l 整个合成过程中这种错误不断积累 , 因此该方法适合比较 短的基因 , 而对长的基因则有目的产 | 物含量低、产物纯化困难的缺点。但它也有优点 , 如可根据研究的需要对一些氨基酸进行定点 | 突变 , 或根据宿主菌的特性 , 在不改变其氨基酸组成的情况下使用宿 主的偏爱密码子 , 以提高 | 产物的产量。 | 对于不同亚型的干扰素 , 由于同源性较高 , 可以用相同的引物从诱 导的小鼠细胞系中提取 mRNA 混合物进行反转录和扩增 , 然后用亚型特异性探针对 CDNA 混 合物进行 Southern 印迹 , 这样便可将序列上相差较小的同种、不同亚型的干扰素基因进行分离 , 为生产高纯度的单一干扰素提供了方法O 三、表达方法 随着对干扰素研究的深入 , 人们了解到鼠干扰素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的 10~40 位、 78~107 位、 123~166 位的 A 、 B 、 C 区 , 尤其是位于 78 和 79 位的氨基酸对抗病毒 | 活性十分重要。而人 IFNt1 的121~136 位对抗病毒活性作用较大 , 人 IFN 子的 N 端 10 个集 | 基酸也是保持其活性所必需的。对干扰素结构的了解为更好地构建基因表达奠定了基础。干 | 扰素最初是用其外源序列进行表达的 , 但近年来的研究表明嵌合表达的干扰素往往优于单一 干扰素 , 因此出现了较多的嵌合表达形式 , 并取得了较好的效果。1.IFN- α的表达家蚕作为一种用于表达外源基因的宿主有易于养殖、生产周期短、夕阳基因表达量高的优点 , 同时由于家蚕为真核生物 , 能对表达产物自行进行糖基化修饰 , 产生有生物活性的蛋白 , 并且在产物提取的过程中只要将家蚕进行匀浆 , 再进行抽提即可 , 操作上十分方便 , 因此 , 它在基因工程领域内被广泛应用。下面便以人IFN, α的生产为例介绍家蚕表达体系在干扰素生产中的应用。 用家蚕核型多角病毒 BIIINPV 体外感染的家蚕传代细胞株 BM-N 通过噬菌斑法纯化得到 BmNPV 的τ 3 亚型。利用从感染脂肪体 mRNA 制得的 CDNA 为探针 , 对其多角蛋白序列进行检验 , 其中 10.5kb 的EcoR I 片段及 3.9 灿的 HindE 片段可与探针杂交 , 将 10.5 灿的EcoR I 片段克隆到 pBR322 中 , 产生质粒 pBmE360 对其用 HindE 切 , 得到 3.9kb 片段 , 其中 | 含有多角蛋白全部序列 ( 图 123 免疫与炎症相关信号通路 一、Jak/Stat Signaling:IL-6 Receptor Family Jak和Stat是许多调节细胞生长、分化、存活和病原体抵抗信号通路中的关键部分。就有这样一个通路涉及到IL-6（gp130）受体家族，它帮助调节B细胞的分化，浆细胞生成和急性期反应。细胞因子结合引起受体的二聚化同时激活受体结合的Jak蛋白，活化的Jak蛋白对受体和自身进行磷酸化。这些磷酸化的位点成为带有SH2结构的Stat蛋白和接头蛋白的结合位置，接头蛋白将受体和MAP激酶，PI3激酶/Akt还有其他的通路联系在一起。受体结合的Stat蛋白被Jak磷酸化后形成二聚体，转移进入细胞核调节目的基因的表达。细胞因子信号传导抑制分子（SOCS）家族的成员通过同源或异源的反馈减弱受体传递的信号。Jak或Stat参与其他受体蛋白的信号传导，在下面Jak/Stat使用表格中有这方面的列举。研究人员已经发现Stat3和Stat5在一些实体肿瘤中被酪氨酸激酶而不是Jaks组成性激活。 JAK/STAT途径介导细胞因子的效应，如促红细胞生成素，血小板生成素，G-CSF，这些细胞因子分别是用于治疗贫血，血小板减少症和中性粒细胞减少症的蛋白质类药物。该途径也通过干扰素介导信号通路，干扰素可以用来作为抗病毒和抗增殖剂。研究人员发现，失调的细胞因子信号有助于癌症的发生。异常的IL-6的信号或导致自身免疫性疾病，炎症，癌症，如前列腺癌和多发性骨髓瘤的发生。Jak抑制剂目前正在多发性骨髓瘤模型中进行测试。Stat3具有潜在促癌性（原癌基因）,在许多癌症中持续的表达。在一些癌细胞中，细胞因子信号传导和表皮生长因子受体（EGFR）家族成员之间存在交流。 目录 英汉缩略语名词对照 (1) 中文摘要 (3) 英文摘要 (9) 论文正文：干扰素诱导基因SLFN5在肝细胞癌中的表达及其抗增殖作用机制研究 (15) 前言 (15) 第一部分：SLFN5在人肝癌组织中的表达情况及其临床意义 (19) 1 材料与方法 (19) 2 结果 (30) 3 讨论 (36) 第二部分：SLFN5对体外培养人肝癌细胞生长抑制作用及其机制研究 (39) 1 材料与方法 (39) 2 结果 (47) 3 讨论 (57) 第三部分：SLFN5基因与Ⅰ型IFN α相关信号通路关系初探 (60) 1 材料与方法 (62) 2 结果 (70) 3 讨论 (75) 全文总结 (80) 参考文献 (83) 文献综述 (90) 致谢 (102) 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录 (103) 万方数据 重庆医科大学博士研究生学位论文 英汉缩略语名词对照 英文缩写英文全称中文全称 BCA Bicinchoninic acid 二喹啉甲酸 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 Cdk cyclin-dependent kinase 周期依赖性蛋白激酶 DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole 4',6-二脒基-2-苯基吲哚ddH2O double distilled water 双蒸水 DEPC Diethyl pyrocarbonate 焦炭酸二乙酯 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲亚砜 ECL Enhanced Chemi-luminescence 增强化学发光 FACS fluorescence-activated cell sorting 流式细胞术 FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清 FITC fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素 GAPDH Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase 磷酸甘油醛脱氢酶 GFP Green fluorescent protein 绿色荧光蛋白 HBV Hepatitis B virus 乙型肝炎病毒 HCC Hepatocellular carcinoma 肝细胞癌 HCV Hepatitis C virus 丙型肝炎病毒 HRP Horseradish Peroxidase 辣根过氧化物酶 IFN Interferon 干扰素 IHC Immunohistochemistry 免疫组织化学 ISGs IFN-stimulated genes 干扰素刺激基因 JAK Janus kinase Janus 激酶 MMP matrix metalloproteinases 基质金属蛋白酶 mRNA messenger ribonucide acid 信使核糖核酸 Na3VO4 Sodium orthavanadium 钒酸钠 OD Optical density 光密度 PAGE polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 万方数据 1 JAK-STAT信号通路 1) JAK与STAT蛋白 JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。 (1) 酪氨酸激酶相关受体（tyrosine kinase associated receptor） 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这包括白介素2?7（IL-2?7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生长激素）、EGF （表皮生长因子）、PDGF （血小板衍生因子）以及IFN（干扰素）等等。这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶JAK（Janus kinase） 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase, RTK），而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK是英文Janus kinase的缩写，Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAK homology domain, JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。(3) 转录因子STAT（signal transducer and activator of transcription）STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“GTFLLRFSS”。 2) JAK-STAT信号通路 与其它信号通路相比，JAK-STAT信号通路的传递过程相对简单。信号传递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK_型干扰素最新研究进展_徐刚
冻干基因工程α1b干扰素使用说明书
I型干扰素诱导的信号通路
基因工程在疾病治疗方面的应用
对已知基因序列的干扰素
(完整word版)免疫和炎症相关信号通路
干扰素诱导基因SLFN5在肝细胞癌中的表达及其抗增殖作用机制研究
肿瘤常见信号通路
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