基因组文库的构建ppt课件

第三章 基因文库的构建和筛选
来自单个基因组的DNA片段克隆的集合体称为基因 文库（gene library或gene bank）。它包括基因组 文库（genomic library）和cDNA文库（cDNA library）。
DNA文库是含有某种生物体全部基因的随机片断的 重组DNA克隆群体。
cDNA文库是克隆的重组cDNA的总和，通常是建 立在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物 种或器官的所有mRNA制备得到的cDNA。
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限制性酶消解用来构建克隆DNA的物理图谱
用酶（KpnⅠ和 Hind Ⅲ）来剪切载体，构建一个 SalⅠ插入片段的不完全酶切图谱。
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M1 2 3 4 5 6 7 8 M
M：标记泳道，
是含有已知不同长度 的DNA，用来衡量 样本DNA的分子大 小。
1：SalⅠ-KpnⅠ； 2：HindⅢ； 3：SalⅠ-HindⅢ； 4：KpnⅠ-HindⅢ； 5：EcoRⅠ； 6：SalⅠ- EcoRⅠ； 7： KpnⅠEcoRⅠ； 8：HindⅢ- EcoRⅠ
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克隆数的确定
建库的关键是如何产生足够数量的重组 DNA，即基因库要建多大才能保证基因 组文库的完整性和代表性。1975 年由 L.Clarke 和 J.Carbon 建立了ClarkeCarbon公式，用来估计一个完整的基因 文库所需的克隆数，对于构建基因组文 库有重要的指导意义。
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典型的基因组文库应能“代表”整套的DNA片 段，这些序列和原来样本中存在的所有DNA序 列相一致，并保持原有的相关丰度。
当需要时，人们能从DNA文库中分离任何特定
的基因片段。
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噬菌体克隆文库的构建。
(a)将外源基因组的DNA片段克隆到噬菌体载体中 来构建基因组文库。菌苔上的噬菌斑中含有大量不 同的重组噬菌体，每一个噬菌斑来自单个感染噬菌 体的一个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
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细胞 基因组 用限制性 酶剪切
用连接酶 连接
λ噬菌体 提取DNA 用限制性酶剪切
尼龙膜 与放射性探针 进行分子杂交
膜
重组噬菌体
重组体DNA
细菌 感染
裂解
释放噬菌体
菌苔 噬菌体克隆文库
噬菌斑中的 噬菌体克隆
用放射自显影 定位阳性克隆 膜
阳性克隆 感染新鲜 的宿主菌
扩增外 源基因
(b) 噬菌斑被转移到尼龙膜上，而噬菌体的蛋白被溶 解，和重组体DNA分开，DNA吸附到膜上。再将此 膜与带有放射性同位素标记的探针进行分子杂交， 可以杂交的便是目的基因。
带有此DNA的克隆可通过放射自显影而显现出来。
这样阳性克隆可从培养基中分离出来，再转接到新
鲜的宿主菌中，使目的因得到扩增。
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(a)用从原有的克隆DNA片段制备的放射性探针能从 典型的基因组文库中分离各种基因片段。用探针1 可用来筛选文库，从文库中分离重组DNA片段。用 探针2和3来获得与上述片段部分重叠的DNA序列。
罕见的酶切位点和重复DNA序列(如Alu分散元件)可 作为界标，用来排列分离的基因组DNA克隆。
(b)从文库中分离的单个的克隆片段含有最小的重叠 DNA片段的复合位点。在图中表示已克隆的50kb的 基因组DNA中含有三个转录的基因。
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用噬菌体置换型载体构建基因文库。
用限制性酶消解噬菌体载体，切除了中央的片段， 再用相同的限制性酶剪切外源基因组DNA，将约 15kb的酶切片段随机地和噬菌体载体的两臂连接， 形成线性的重组的串联体。
用体外包装系统将串联体中单个的基因组DNA分 别包装入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌 体颗粒。
用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每 一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。
各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
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限制性
(a)
酶切位点
Alu散在元件
启动子 外显子探针1 启动子启动子
探针2
探针3
(b) mRNA
mRNA
mRNA 5kb
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7Hale Waihona Puke Baidu
一个典型的基因组文库含带有重叠基因片段的多拷 贝克隆。
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将数据代入上式
N ln(1 0.99) ln(1 20kb/ 3Gb)
= 7×105
N的含义是克隆大小为20kb的人类DNA时，所构建的 基因文库数必须在7×105 个以上克隆时，才能以99 ％的概率得到此克隆。
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二、构建基因文库的克隆载体 和筛选策略
构建基因组文库的第一步是将基因组 DNA用限制性酶切成小片段，但酶的选 择和酶切反应条件的选择是取决于克隆 载体的类型
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三、亚克隆
所谓亚克隆（sub-clone）就是对已经克隆的目 的DNA片段经限制性酶消解后再次重新克隆， 其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或进 行“重编程”。
亚克隆的基本过程：
①制备目的DNA片段和载体；
②连接目的DNA片段和载体；
③重组载体转化到宿主中；
④筛选重组子。
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噬菌体克隆文库的构建。 (a)将外源基因组的DNA片段克隆到噬菌体载 体中来构建基因组DNA文库。菌苔上的噬菌斑 中含有大量不同的重组噬菌体，每一个噬菌斑 来自单个感染噬菌体的一个克隆。
(b) 噬菌斑的模式被转移到尼龙膜上，而噬菌体 的蛋白被溶解，和重组体DNA分开，DNA吸附 到膜上。再将此膜与带有放射性同位素标记的 探针进行分子杂交，可以杂交的便是目的基因。
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Clarke-Carbon公式
任一DNA序列在文库中出现的概率：
N ln(1 p ) ln(1 I / G )
N：该序列需要克隆的总数； P：待克隆DNA序列在文库中设定的出现概
率，一般为99％； I ：待克隆DNA片段的长度，假定为20kb; G : 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp
无论是建立基因组文库还是cDNA文库，其目的是：
①从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；
②是从来源复杂的总mRNA的cDNA文库中分离稀
有的cDNA克隆。
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第一节 基因文库的构建
一、基因组文库和cDNA文库
基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机 片断的重组DNA克隆群。其中可能含有基因外 显子、内含子、基因5'端调控区、3'端的尾随 序列以及基因间的间隔区。