下载文档原格式
Ⅰ顺铂-聚谷氨酸复合物药物修饰系统的建立及应用Ⅱ基于RCAS-TV A系统的小鼠乳腺癌发病模型的建立及应用【摘要】：恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和生命,对于肿瘤发病机制及抗肿瘤药物的开发已经投入了大量的人力、财力和物力。
顺铂(cisplatin,CDDP)是目前临床上化疗的首选药物之一,具有抗癌活性谱广,杀伤作用强等优点,然而研究表明：铂类抗肿瘤药物属周期非特异性药物,半衰期长,溶解度低,细胞毒性大,无靶向性,大大限制了其在临床上长期和高剂量的使用。
因此,研究和开发低毒高效的顺铂类似物,一直是药物修饰领域的研究热点。
随着材料科学技术的发展和应用,高分子聚合物作为药物载体的研究越来越多,基于肿瘤组织内部特有的高通透性和滞留效应(EPR效应),高分子药物载体通过与药物的相互作用,可以提高药物的水溶性,改善药物的药代动力学特性,调控药物在组织中的分布,靶向给药,降低药物的毒副作用或药源性疾病等,对于提高药物的安全性和稳定性具有很高的应用价值。
枯草芽孢杆菌发酵来源的γ型聚谷氨酸(γ-PGA)就是一种良好的药物载体,它具有结构单一、制备工艺简单、良好的生物相容性和生物可降解性、良好的缓释和控释性能等优点,近年来,以y-PGA作为载体的研究备受关注。
基于以上研究背景,为开发一种半衰期长、毒性低、具被动靶向和缓释效果的顺铂类似物,我们将顺铂巧妙地连接到生物发酵合成的γ-聚谷氨酸药物载体上,制备顺铂-聚谷氨酸复合物(γ-PGA-CDDP),在实验室原有研究基础上,进一步研究该复合物的性质；将其与临床常用化疗药物进行比较；并制备γ-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物(GlutamineAspartatePolymers,GAP460)以提高药物载量。
具体研究内容和结果分为以下两个方面：(1)枯草芽孢杆菌发酵制备γ-PGA,通过优化反应条件,制备γ-PGA-CDDP复合物,并借助红外吸收光谱和核磁共振的方法对复合物进行表征鉴定。
γ-聚谷氨酸发酵关键技术的研究γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是微生物合成由谷氨酸单体缩合形成的高聚物,单体间以酰胺键相互连接,具有多种优良特性,如无毒、生物可降解、生物相容、强溶于水等,广泛用于食品、环保、农业等领域。
本文从γ-PGA生产菌的诱变选育和发酵过程优化展开研究,以期提高γ-PGA产率。
主要研究内容如下:(1)采用ARTP 技术对出发菌株L13进行诱变处理,诱变条件为:处理距离2 mm、最佳处理时间300 s、样品加量10μL、通气量10 SLM。
以不产生脂肽和γ-PGA高产作为筛选标准,从突变库中筛选获得一株性能优良的突变株ZF5。
通过摇瓶发酵与5 L罐分批发酵验证,该菌株发酵过程仅产生少量泡沫,不产生脂肽副产物,在5 L罐中发酵18hγ-PGA产率达到26.1 g/L。
(2)在对枯草芽孢杆菌ZF5发酵特性研究基础上,通过添加适量的金属离子、氨基酸对γ-PGA发酵进行调控,以提高γ-PGA产率。
结果发现:Ca2+、Mo6+能够促进菌体的生长和γ-PGA的生物合成,最适浓度分别为0.1 g/L和0.06 g/L;Zn2+对菌体生长和产物合成都无显著影响;Cu2+和Mn2+对菌体的生长有一定抑制作用,但是Mn2+对γ-PGA产物积累促进作用最强,添加0.3 g/L的Mn2+发酵24 hγ-PGA产率最高为28.5 g/L,较对照提高了11.8%。
谷氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸对γ-PGA的合成具有促进作用,其中谷氨酸、天冬氨酸效果更为显著。
在发酵初始添加3 g/L的L-谷氨酸可使γ-PGA产率提高23%,最高达到31.5 g/L;在稳定期添加5 g/L的L-天冬氨酸可使γ-PGA产率提高17.6%,达到30.7 g/L。
(3)通过单一pH控制发酵策略研究发现,菌株ZF5最适生长pH为6.5,产物γ-PGA积累的最适pH为7.0。
通过两阶段pH控制策略有效地实现了菌体快速生长和γ-PGA合成最大化。
![一种γ-聚谷氨酸生物有机肥的制备及应用方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/0c5f8dddafaad1f34693daef5ef7ba0d4a736d91.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911142514.X(22)申请日 2019.11.20(83)生物保藏信息CGMCC No.17215 2019.01.18(71)申请人 中国科学院成都生物研究所地址 610041 四川省成都市人民南路四段9号(72)发明人 闫志英 房俊楠 刘杨 许力山 姬高升 (74)专利代理机构 成都坤伦厚朴专利代理事务所(普通合伙) 51247代理人 刘坤(51)Int.Cl.C05C 11/00(2006.01)C12P 13/02(2006.01)C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称一种γ-聚谷氨酸生物有机肥的制备及应用方法(57)摘要本发明属于生物化肥领域，具体涉及一种γ-聚谷氨酸生物有机肥的制备及应用方法。
具体技术方案为：一种γ-聚谷氨酸生物有机肥，具体由枯草芽孢杆菌8-2发酵制备得到，所述枯草芽孢杆菌8-2保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为C G M C CNo.17215。
本发明以农业废弃物秸秆和豆粕为主要基质、利用微生物固体发酵生产γ-PGA，有效减少了发酵成本，同时把发酵结束后含有γ-PGA的固体发酵基质直接用作生物有机肥料，既简化了下游的分离提纯步骤，又减少了化学肥料的使用，同时还能显著促进农作物的生长；为解决农业废弃物资源化利用问题及减少化肥使用量提供了新思路。
权利要求书1页 说明书9页序列表1页 附图1页CN 110845253 A 2020.02.28C N 110845253A1.一种γ-聚谷氨酸生物有机肥，其特征在于：所述γ-聚谷氨酸生物有机肥由枯草芽孢杆菌8-2发酵制备得到，所述枯草芽孢杆菌8-2保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.17215。
2.根据权利要求1所述的γ-聚谷氨酸生物有机肥，其特征在于：所述γ-聚谷氨酸生物有机肥的发酵基质包括：玉米秸秆、大豆豆粕和味精粕。
γ-聚谷氨酸生产、合成机制和抗冷冻性的研究γ-聚谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)是一种多聚氨基酸类的环保型多功能生物可降解高分子材料,分子量一般在10~1000 k Da左右。
γ-PGA具有一些独特的物理、化学和生物学特性如良好的水溶性,超强的吸附性,能彻底被生物降解,无毒无害,可食用等,可广泛应用于农业、食品、医药、化妆品,环保等领域。
微生物合成γ-PGA是一个复杂的生理代谢过程,目前的研究多集中于γ-PGA产生菌株的筛选和产量的提高,而对于γ-PGA合成机制缺乏足够的研究和可靠的结论。
本研究筛选了一株可不依赖谷氨酸发酵的γ-PGA高产菌株,对内源谷氨酸的合成途径进行了探讨,克隆表达了γ-PGA合成酶基因,并对γ-PGA产物的抗冷冻性进行了研究。
从稻田根际土壤中筛选得到一株非谷氨酸依赖型γ-PGA产生菌株,根据生理生化特征,16S r RNA序列比对,将菌株鉴定为甲基营养芽孢杆菌并命名为Bacillus methylotrophicus SK19.001,其16S r RNA基因全长为1417 bp,已提交Gen Bank并获得基因登录号为JQ723479。
利用薄层层析法、高效液相色谱法分析、傅里叶红外光谱法以及核磁共振法对产物结构进行了鉴定和分析。
测定了各种碳源和氮源对B.methylotrophicus SK19.001产γ-PGA的影响,结果表明SK19.001对碳源的利用十分广泛,而对氮源的利用具有局限性,只能利用有机氮源,柠檬酸钠在发酵过程中可显著促进γ-PGA的产生,15 g/L的添加量可使γ-PGA产量提高76.5%。
在含有30 g/L甘油,15 g/L柠檬酸钠以及50 g/L 蛋白胨的培养基中,发酵36 hγ-PGA产量达到33.84 g/L,不产生多糖等副产物,分子量超过10000 k Da,其中D-谷氨酸含量为65%~70%。
三羧酸循环中间体和谷氨酸家族的氨基酸独自作为碳源能够参与γ-PGA的合成,除谷氨酰胺外,这些前体的合成效率相当。
DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.004 ·论著·γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物的制备及其生物活性李文娟，冯震，薛晓敏，黄静，吴自荣【摘要】目的研究一种低毒性的顺铂复合物：γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物（γ-PGAasp-CDDP），考察其体外性质和体内毒性，并探讨可能的作用机制。
方法γ-聚谷氨酸与天冬氨酸发生酰胺化反应制备γ-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，核磁共振对其结构进行表征；化学法制备γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物；常规方法检测该复合物稳定性；透析法研究药物缓释效果；MTT 法检测复合物体外抗肿瘤细胞活性；流式细胞仪检测其对细胞凋亡的作用；小鼠体内实验检测其体内毒性。
结果成功制备γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物，顺铂的有效结合率达 30%；该复合物在常温中性环境下稳定；30 h 时顺铂的累计释放率达到 30%；细胞实验表明复合物对Bcap-37（人乳腺癌细胞）和 BEL7404（人肝癌细胞）具有显著的杀伤作用，小鼠体内实验表明该复合物的毒性比游离顺铂低。
结论γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物仍然保留了游离顺铂的生物活性，在杀伤肿瘤细胞、引起细胞凋亡的同时，大大降低了体内毒副作用，其作用机制可能与实体瘤组织的高通透性、滞留效应（EPR 效应）以及药物缓释作用有关，因此该复合物具有潜在的临床应用价值。
【关键词】药物载体；药物释放系统；顺铂；γ-聚谷氨酸-天冬氨酸 中国医药生物技术, 2010, 5(2):98-104恶性肿瘤是当前严重影响人类健康的主要疾病之一，顺铂[cis-dichlorodiammineplatinum（II），CDDP]类配合物是目前应用最为广泛的抗肿瘤药物，但因其具有严重的毒副作用，限制了临床应用[1]。
将抗肿瘤药物载于高分子载体上，靶向性输送到肿瘤组织（即被动靶向）[2]，极大地提高了药物的生物利用率，有效地降低药物的毒副作用并提高用药剂量，是目前药物释放领域研究的热点之一，国外报道的有微球体、纳米微粒、脂质体和微型胶囊等[3-7]。
本实验室曾以γ-聚谷氨酸作为载体连接顺铂，制备聚谷氨酸-顺铂复合物，并取得较好的结果[8]。
但是仅以小分子γ-聚谷氨酸作为载体还存在载药量低和载体用量大的缺点，本文采用了一种连接效率更高的新型药物载体：γ-聚谷氨酸-天冬氨酸，利用其活性基团羧基连接顺铂，制备γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物，并对其体内外性质进行研究。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂 H-Asp（O t Bu）-O t Bu·HCl（Asp，Mr 296.8）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC）购自吉尔生化（上海）有限公司；γ-聚谷氨酸标准品、顺铂（CDDP，纯度 > 99.9%）、噻唑蓝（MTT）、碘化丙啶（PI）购自美国 Sigma 公司；三氟乙酸（TFA）、邻苯二胺（OPDA）购自上海化学试剂公司。
1.1.2 主要仪器 ELx800 酶标仪为美国 Bio-Tek 公司产品；FACScan 流式细胞仪为美国 Becton Dickinson 公司产品；Avance 500 MHz 核磁共振仪为德国 Bruker 公司产品。
1.1.3细胞系枯草芽孢杆菌（Bacillus．sp）由本实验室筛选并保存；Bcap-37 细胞（人乳腺癌细胞）、BEL7404 细胞（人肝癌细胞）购自中国科学院上海细胞研究所；DMEM 培养基（Gibco）（含10% 小牛血清）购自吉尔生化（上海）有限公司。
1.1.4实验动物昆明小白鼠，雌性，5 周龄，体重 18 ~ 20 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，质量合格证号：SCXK（沪）2007-0005。
1.2 方法1.2.1γ-聚谷氨酸-天冬氨酸聚合物的合成及结构表征由枯草芽孢杆菌发酵得γ-聚谷氨酸[9]，利用温和降解法[10]，调 pH 至 4.0，80 ℃水浴 165 min基金项目：上海市科委 2008 年度重点科技攻关专项（08431902400）作者单位：200062 上海，华东师范大学生命科学学院通讯作者：吴自荣，Email：zrwu@收稿日期：2009-12-02后冰浴冷却，调 pH 至中性，透析纯化，冷冻干燥得小分子γ-聚谷氨酸（sγ-PGA）。
将sγ-PGA、Asp 及 EDAC 按摩尔比4:2:3 以蒸馏水充分溶解，搅拌 4 h，离心收集白色沉淀，加 TFA，37 ℃振荡反应 2 h 后，加入 10 倍体积的无水乙醚，离心收集白色沉淀。
将得到的固体溶于蒸馏水中，调pH 至 7.0，透析纯化 48 h，冷冻干燥，即得载体γ-聚谷氨酸-天冬氨酸（γ-PGA-asp）。
0.8% 的琼脂糖凝胶电泳测定其分子量[11]（以下称电泳法）。
γ-PGA-asp 结构表征：将 15 mg 样品溶于500 μl D2O 中，利用Avance 500 MHz 核磁共振仪进行核磁共振 H 谱（1H NMR）检测。
1.2.2γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物的制备及分子量测定将γ-PGA-asp、CDDP 以摩尔比5:1 混合，去离子水溶解，调 pH 至 7.0，密封，避光37 ℃温育 48 h。
透析纯化 48 h 后，收集样品，OPDA 法进行 CDDP 定量[8]，定量后样品冷冻干燥，得到白色絮状产物，即γ-PGAasp-CDDP 复合物。
电泳法测定其分子量。
有效结合率=（检测到的顺铂质量/参加反应的顺铂总质量）× 100%。
1.2.3γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物稳定性实验1.2.3.1不同温度对γ-PGAasp-CDDP 复合物的影响γ-PGAasp-CDDP 复合物样品 500 μl /管分装，分别置于4、37、60 ℃水浴。
分别在第0、10 天取样，电泳法检测其载体变化，OPDA 法检测药物稳定性[8]。
1.2.3.2不同 pH 值对γ-PGAasp-CDDP 复合物的影响γ-PGAasp-CDDP 复合物样品分别调 pH 至 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，37 ℃水浴，检测方法同 1.2.3.1。
1.2.4γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物对顺铂的缓释作用将γ-PGAasp-CDDP 复合物溶液（已知CDDP 浓度 1 mg/ml）加入透析袋中放入 37 ℃磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4）中透析 48 h，每隔 1 h 从透析液中取 1 ml 样品，同时再加入 1 ml 新 PBS 溶液，每隔 10 h 取样，用 OPDA 法检测 CDDP 的量，并计算其累计释放率。
1.2.5γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物对肿瘤细胞的影响1.2.5.1γ-PGAasp-CDDP 复合物抑制细胞增殖作用将 Bcap-37 和 BEL7404 细胞分别在 96 孔（l × 104 个细胞/孔）细胞培养板中培养 24 h，待细胞贴壁去除培养基，再加入含不同浓度游离 CDDP、γ-PGAasp-CDDP 复合物的新鲜培养基 200 μl /孔，每个浓度做 4 个复孔，置于 37 ℃，5% CO2培养箱中分别培养 24、48、72 h。
每孔加入 20 μl 浓度为 5 mg/ml 的 MTT，继续培养 4 h。
吸去培养液，加入 200 μl DMSO，充分振荡，于酶标仪波长570 nm 处测定吸光值，并计算 IC50 值。
1.2.5.2 γ-PGAasp-CDDP 复合物对细胞凋亡的影响于 25 cm2 的细胞培养瓶中分别培养 Bcap-37 和 BEL7404 细胞，待细胞长至 80% 时加 20 μg/ml 的药物作用 24 h，分别设定对照组（游离 CDDP），实验组（γ-PGAasp-CDDP 复合物），处理样品[11]，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.2.6 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物在正常小鼠体内的毒性实验昆明雌鼠按体重分为 3 组：PBS 组、游离 CDDP 组及γ-PGAasp-CDDP 复合物组，每组 10 只。
分别于第1、4、7 天以腹腔注射给药，注射剂量为 4 mg/kg（以 CDDP 计量）。
每天记录小鼠的存活和体重变化情况。
2 结果2.1 药物载体 γ-聚谷氨酸-天冬氨酸的制备及结构表征由枯草芽孢杆菌发酵得大分子γ-聚谷氨酸（γ-PGA），利用温和降解法制备得小分子聚谷氨酸（sγ-PGA），sγ-PGA、Asp 在 EDAC 催化作用下，发生酰胺化反应，形成复合物γ-PGA-asp。
透析纯化后，冷冻干燥得γ-PGA-asp，氨基酸分析得γ- PGA-asp 中γ-PGA:Asp 约为 2 ~ 3:1（摩尔比，数据未显示），合成路线及模式图见图1。
γ-PGA-asp 结构表征1H-NMR（D2O）结果见图2。
其中，δ1.95、1.9 ppm 处为γ-PGA 的β-CH2-峰，δ2.3 ppm 处为γ-PGA 的γ-CH2- 峰，δ4.25、AB 图 1 γ-聚谷氨酸-天冬氨酸合成路线及其模式图Figure 1The synthesis route of γ-PGA-asp and its ideographγPGA:β-CH 2γ-CH 2ASP:β-CH 2α-CHNHppm 9 8 7 6 5 4 3 2 １图 2 γ-聚谷氨酸-天冬氨酸的核磁共振 H 谱Figure 2 1H NMR of the γ-PGA-asp图 3 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物的合成路线模式图Figure 3 The synthesis route ideograph of the γ-PGAasp-CDDP4.41 ppm 分别为 γ-PGA 和 Asp 的 α-CH- 峰，δ2.95 ppm 为 Asp 的 β-CH 2- 峰，δ8.06、8.35 ppm 处为 γ-PGA 和 Asp 的 -NH- 峰。
该结果说明 γ-PGA 与 Asp 已连接。
2.2 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物的制备及分子量测定CDDP 通过其上的 Cl 原子与载体侧链上的活性基团羧基反应，形成化学键获得 γ-PGAasp-CDDP 复合物，CDDP 与载体有多种结合方式，图 3 模式图为其中三种类型。
OPDA 法检测 γ-PGAasp-CDDP 复合物中可逆结合的 CDDP 的量，有效结合率达 30%。
电泳法测定复合物的分子量，结果如图 4所示：泳道 4 为载体 γ-PGA-asp ，分子量约为 20 ~ 60 kD；泳道 5 为 γ-PGAasp-CDDP 复合物，说明载体 γ-PGA-asp 连接上 CDDP 以后分子量变大，约为 30 ~ 60 kD 。
