酶工程酶的生物合成法生产共141页

酶工程
第二章 酶的发酵工程
（二）培养条件对产酶的影响与调节控制
1. pH对产酶的影响与调节控制 细菌、放线菌：中性至微碱性；霉菌、酵母菌：微酸性 培养基pH的改变会影响产酶的种类或比例 调节控制 控制培养基的组分或比例；添加pH缓冲物种；流 加酸碱溶液或补料；提高空气流量
酶工程
第二章 酶的发酵工程
脂肪酶；理氏木霉—木聚糖酶、纤维素酶； 青霉—葡萄糖氧化酶、5/-磷酸二酯酶
酶工程
第二章 酶的发酵工程
（二）产酶菌种的要求
（1）酶的产量高； （2）容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性强，便 于管理； （3）菌株遗传性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，保 证生产的稳定性； （4）菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低； （5）有利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶； （6）菌株安全可靠，非病原菌，不产毒素及其它有害物质，不 影响生产人员的身体健康； （7）基因工程菌必须符合安全性要求。
酶工程
第二章 酶的发酵工程
6. 菌种的退化与复壮 （1）菌种退化现象：随着菌种保藏时间的延长或多次
的转接传代，菌种本身所具有的优良遗传性状发生了不利 于发酵生产的遗传变异现象。
（2）防止退化措施：创造合适的培养条件，采取有效 的菌种保藏方法，尽量减少传代次数。
（3）退化菌种的复壮：纯种分离和性能测定。包括已 发生退化菌种的复壮和菌种退化之前的复壮和提高。
4
Pr
酶工程
第二章 酶的发酵工程
（三）酶生物合成的诱导作用
合成方式
酶
组成酶：细胞所固有的酶 诱导酶：在诱导物的诱导作用下合成的酶
诱导物 — 底物、产物、底物结构类似物（IPTG）
诱导 协同诱导：诱导物同时诱导几种酶的合成 作用 顺序诱导：先后诱导不同酶的合成

• 某些物质（容易利用的碳源）经过分解代谢产生的 物质阻遏了某些诱导酶生物合成的现象
• 连锁效应
• 实质 —— cAMP 通过启动基因调控酶的合成
微生物发酵产酶
• 酶生物合成的调节 A. 无诱导物
—— 转录水平
…R P
O
S1 S2
…
– 调节模式 2：诱导作 阻遏蛋白
用
B. 添加诱导物
• 加入某些物质（诱
• 酶生物合成的过程
– 肽链的合成 —— 翻译
• 以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过 各种tRNA、酶和辅助因子，合成多肽链的过程
• 氨基酸活化生成氨酰-tRNA • 肽链合成起始
微生物发酵产酶
• 酶生物合成的过程
– 肽链的合成 —— 翻 译
• 肽链延伸
• 肽链合成的终止
• 肽链翻译后加工
时间
细胞浓度 酶浓度
微生物发酵产酶
• 酶生物合成的模式
– 延续合成型
细
• 酶的合成伴随着细胞的生长
而开始，生长进入平衡期 后
/
胞
酶 浓
，酶还能延续合成 一段时间 度
• 此类酶的合成可被诱导物所
诱导，一般不受分解代谢物 阻遏
• 此类酶所对应的 mRNA 稳定 性好
• 举例：黑曲霉培养生产聚半
时间
细胞浓度 酶浓度
时间
滞后合成型
时间
微生物发酵产酶
• 酶生物合成的模式
– 同步合成型
细
胞
/
• 酶的生物合成与细胞生长同 酶
步进行（生长偶联 型）
浓
度
• 大部分组成酶属于此类
• 此类酶的合成可由其诱导物
诱导生成，不受分解代谢物 阻遏和反馈阻遏作用

• 10）红曲霉
• 淀粉酶、糖化酶、蛋白酶
• 11）啤酒酵母
• 啤酒和酒类生产 • 转化酶、丙酮酸脱羧酶
• 12假丝酵母
• 脂肪酶、尿酸酶、转化酶、醇脱氢酶
2植物细胞
• 植物细胞培养主要用于:色素、药物、香精 和酶蛋白的生产 • 其中用于产酶的细胞 • 番木瓜细胞------木瓜蛋白酶 • 大蒜细胞----------超氧化物歧化酶 • 胡萝卜细胞-------糖苷酶
•解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株 •解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株
2. 基因工程育种
（二）条件控制 1. 添加诱导物
酶的底物类似物最有效。
2. 降低阻遏物浓度
除去终产物 产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖 分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富 添加一定量的cAMP
固定化原生质体技术
• 20世纪80年代发展 • 便于胞内酶的分离纯化
微生物酶的类型
1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、
纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的 大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞 内也能维持较低水平，受到的调节控制少。 2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶， 酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。
所需的 酶
分离纯化技术
酶的发酵液
第一节 细胞的选择
• • • • • • 用于酶生产的细胞必须具备条件： 1）酶的产量高； 2）容易培养和管理； 3）产酶稳定性好； 4）利于酶的分离纯化； 5）安全可靠，无毒性。
大多数酶采用微生物发酵生产，部分采用 植物细胞和动物细胞
1产酶微生物
• 利用微生物产酶优势：
4动物细胞培养基

酶发酵生产的一般工艺流程图
保藏菌种
试管斜面培养（活化）
摇瓶扩大培养
种子罐培养 培养基 发酵罐
分离纯化 酶
无菌空气
二、酶生产菌种 （一）产酶菌种的要求
（1）产酶量高； （2）繁殖快，发酵周期短；
（3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；
（4）能够利用廉价原料，容易培养和管理； （5）安全性可靠，非致病菌。
液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件 下发酵。
2、固体培养发酵
培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌 株，在一定条件下发酵。
3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）
将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。
4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。
酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏
1、酶合成的诱导作用
加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为 诱导作用。 诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。 例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导a-淀粉酶的合成
2、酶合成的阻遏 （1）终产物阻遏
指酶催化反应的产物或代谢途 径的末端产物使该酶的生物合成受 到阻遏的现象。
二、应用微生物来开发酶的优点 1、微生物种类多，酶种丰富； 2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶； 3、微生物培养基来源广泛，价格便宜； 4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程； 5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选 育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。
三、酶发酵生产的类型 1、液体深层发酵：
第二节 酶生物合成的基本理论
一、酶生物合成的过程
DNA
转录
RNA

05
微生物发酵产酶存在问题与挑战
产量问题
微生物发酵产酶产量低
由于微生物发酵过程中受到多种因素 的影响，如营养物质的供应、发酵条 件、微生物菌种等，导致酶的产量较 低。
发酵周期长
微生物发酵产酶通常需要较长的发酵 周期，这增加了生产成本和时间成本。
稳定性问题
酶稳定性差
许多酶在发酵过程中容易受到温度、pH值、金属离子等因素的影响，导致酶的稳定性降低。
04
微生物发酵产酶应用实例
工业应用
洗涤剂制造
微生物发酵产生的酶可用于制造 洗涤剂，如蛋白酶用于去除蛋白 质污渍，淀粉酶用于去除淀粉污
渍。
纺织工业
利用微生物发酵产生的酶处理纺织 品，可以改善其质地、手感和外观， 如纤维素酶用于棉织物的生物抛光。
造纸工业
通过微生物发酵产酶技术，可以改 进造纸工艺，提高纸张质量和降低 环境污染，如木聚糖酶用于纸浆漂 白。
过程优化与控制
通过人工智能技术，对微生物发酵产酶过程进行建模和优化，提高 目标酶的产量和质量。
个性化定制酶
结合人工智能和基因工程技术，实现个性化定制酶的合成，满足不 同领域的需求。
THANKS
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《酶工程》课件-微生物发酵 产酶
• 微生物发酵产酶概述 • 微生物发酵产酶原理与过程 • 微生物发酵产酶技术与方法
• 微生物发酵产酶应用实例 • 微生物发酵产酶存在问题与挑战 • 未来发展趋势与展望
01
微生物发酵产酶概述
酶工程简介
酶工程定义
酶工程是生物工程的重要组成部分，是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、 细胞器等具有的生物催化功能，借助工程手段来生产有用物质、设计改造酶或 者生产细胞、器官乃至整个生物体的一门科学技术。

三、温度的调节控制
1.细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所不同，而且往往低 于最适生长温度。
2.有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同的温度条件。
五、溶解氧的调节控制
调节溶解氧的方法： （1）调节通气量 （2）调节氧的分压 （3）调节气液接触时间 （4）调节气液接触面积 （5）改变培养基的性质
二、植物细胞
P38 表3-1
三、动物细胞
CHO B16
A549 spleen
第二节 培养基的配制
培养基：是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质 的混合物。
培养基的分类： 按形态分类
固体培养基 平板培养基
斜面培养基
半固体培养基
液体培养基
按用途分类 保藏培养基 种子培养基 生长培养基 发酵培养基 产酶培养基 微生物培养基 植物培养基、 动物培养基
化学物质
能源谱
无机物：化能自养微生物的能源（不同于碳源）
辐射能：光能自养和光能异养微生物的能源
化能自养微生物的能源物质：都是一些还原态的无机物质，例如：NH4+、 NO2-、S、H2S、H2、Fe2+ 等，能利用这些物质作为能源的全部是细菌，如： 硝酸细菌、亚硝酸菌、硫化细菌、硫细菌、铁细菌、硫细菌、氢细菌和铁细 菌等。这些无机养料常常是双功能的（如： NH4+ 既是硝酸细菌的能源，又 是它的氮源。）
产酶种类：
α-淀粉酶 蛋白酶 β-葡聚糖酶 碱性磷酸酶等
代表菌种：AS1.398
大肠杆菌
细胞成杆状，0.5μm*（1~3） μm，无芽孢，G-，菌落从白 色到黄色，光滑闪光，扩展。
产酶种类：一般生产胞内酶 谷氨酸脱羧酶 天冬氨酸酶 苄青霉素酰化酶 基因工程研究用酶等

Section 4 固定化微生物细胞发酵产酶
一、固定化微生物细胞发酵产酶的特点： 二、固定化微生物细胞发酵产酶的工艺条件控制： 三、固定化微生物细胞生长和产酶动力学：

Section 5 固定化微生物原生质体发酵产酶
一、固定化微生物原生质体的特点： 二、固定化微生物原生质体发酵产酶的工艺条件控制：
三、发酵工艺条件及其控制 1、细胞活化与扩大培养

2、培养基的配制： ①碳源: ②氮源: ③无机盐: ④生长因子等。 3、pH值的调节控制： 4、温度的调节控制： 5、溶解氧的调节控制：


四、提高酶产量的措施： 1、添加诱导物： ①酶的作用底物 ②酶的反应产物 ③酶的底物类似物： 2、控制阻遏物的浓度： 3、添加表面活性剂： 如：吐温(Tween)、特里顿(Triton)等， 4、添加产酶活性剂：
Chapter Two 酶的生物合成法生产
Section 1 基本概述 一、酶的生物合成法生产概念 1、酶的生物合成 2、酶的发酵生产 3、酶的生物合成法生产 二、优良的产酶细胞应具备的条件 1、酶的产量高； 2、易培养和管理； 3、产酶稳定性好； 4、利于分离纯化； 5、安全可靠等。
开始，而在细胞进入平衡期后，酶的合成也随之停止。
④滞后合成型：只有当细胞生长进人平衡以后，酶才
开始合成并大量积累。
2、细胞生长动力学：

在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比：
式中: rX——细胞生长速率 X-----细胞浓度 μ——比生长速率


当培养物中只有一种限制性基质，而不 存在其它限制生长的因素时，μ为此限制性 基质浓度的函数，这就是Monod生长动力学 模型：

33
Buchner兄弟的试验：
用细砂研磨酵母细胞，压取汁液，汁液 不含活细胞，但仍能使糖发酵生成酒精和二 氧化碳。 证明：发酵与细胞的活动无关。
34
The Nobel Prize in Chemistry 1907
"for his biochemical researches and his discovery of cell-free
19
生物催化剂发展的工业展望
Competitive Imperative
Speed to Market
Current Chemical Varieties
2-5 years
Current Biocatalyst
s
10 years
Biocatalyst of the Future
2-3 years
Cost to Manufacture
机结合而产生的边缘交叉科学。
• 应用主要集中于食品工业、工业和医药工业等领 域。
• 酶工程是生物技术的重要组成部分。
3
二、酶工程相关概念
生物工程(Bioengineering)又称生物技术 或生物工艺学(Biotechnology). 20世纪70 年代发展起来的一门新的综合性技术学科。 综合运用生物学、化学和工程学技术，改造 物种、创造新物种，改造生物体中的某些组 分(如酶、蛋白质、核酸、细胞器)，利用生物 体的某些特殊机能(如酶的催化功能、抗体 的免疫功能等) 为工农业生产以及医疗卫生 服务。
that enzymes
virus proteins in a pure form"
can be
crystallized"
James Batcheller Sumner

2、 产酶微生物的安全性要求
申 请酶许制可剂证生须产包时括以需下通资过料安：全检查
酶及其来源微生物的描述
医酶药制和备方食法品：酶培养制基剂的完需全进组成行；生毒产性设备试；验发酵条件(通气、 尚酶未制在剂的法搅组拌规、成温机度构等)GRAS(公认为安全的)的食
品生单产一或酶、加复合工酶的或是清整单个细中胞 的微生物，需申请 许可证 杂质如重金属、溶剂痕迹或来源于生产过程中的其他化学物质
制取青霉素酰化酶，谷氨酸脱羧酶和酸性蛋白酶等
假丝酵母属(Candida)
产生单加氧酶，双加氧酶，用于烃类等石油产品的降解
.
11
4、 霉菌
菌种
(1) 根霉(Rhizopus)
少根根霉 (R.arrhizus) 代氏根霉 (R. delemar) 匍枝根霉 (R. stolonifer) 其它
(2) 木霉
➢ 目前酶发酵生产的主要方式 ➢ 适于微生物，植物、动物细胞及工程菌的发酵 ➢ 优点：机械化强度高；易于管理控制；生产效
酶及功能
α-淀粉酶，蛋白酶，青霉素酶，溶菌酶 5’-磷酸二酯酶，用于水解RNA，生产核苷酸和核苷等 纳豆激酶，溶解血栓，抑制金黄色葡萄球菌、大肠埃氏菌O157菌株
及沙门氏菌的作用 α-半乳糖苷酶，青霉素酶等
异构酶，溶菌酶等
环糊精葡基转移酶(用于由淀粉生产环状糊精)，丁酰苷酶A、B等
头孢菌素酰化酶(用于酶法半合成生产各种头孢菌素衍生物，如先 锋毒素Ⅰ－Ⅴ等)
亮白曲霉 (A. candidus)
黄柄曲霉 (A. flacipes)
酶及功能
淀粉酶，蛋白酶，果胶酶葡萄糖氧化酶等 蛋白酶， 果胶酶等 蛋白酶，果胶酶等 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶

（cAMP-CRP）结合位点 操纵基因：与阻遏蛋白结合
结构基因：蛋白多肽链产物
酶工程第三章酶生物合成法生产
28
基因操纵子调节系统示意图
调节基因 转录
操纵子
控制区
信息区
启动基因 操纵基因 RNA聚合酶
结构基因 DNA
（-）
（+） 转录
翻译
mRNA
阻遏蛋白
诱导剂
酶工程第三章酶生物合成法生产
翻译 蛋白质 29
只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，
RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合
成才能开始。
R
P
O
S
DNA
CRP-cAMP 复合物
CRP+cAMP
cAMP-CRP复合物的作用示意图
酶工程第三章酶生物合成法生产
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操纵基因（Operater gene）:
位于启动基因和结构基因之间的一段碱基 顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋 白结合，操纵酶合成的时机与速度。
第二章 内容总结
酶工程第三章酶生物合成法生产
1
1、细菌
属原核单细胞生物，有球菌、杆菌和螺旋菌三类， 分革兰氏阳性菌和阴性菌。在发酵专业中常用的是杆菌，
它易形成芽孢。
2、放线菌 属原核生物，菌落呈放射状，广泛存在于泥土中，
最大经济价值是用来生产抗生素。
3、霉菌 属真核生物，俗称丝状真菌。在发酵工业、农业、食品
★诱导作用的类型：
同时诱导：诱导物加入后，微生物 能同时诱导出几种酶的合成，主要存在于 短的代谢途径中。
顺序诱导：先合成能分解底物的酶，
再合成分解各中间代谢物的酶达到对复
杂代谢途径的分段调节。