第三章酶的生物合成法生产

3动物 细胞
• 动物细胞培养主要用于疫苗、抗体、激素、 多肽、酶的生产 • 人黑色素瘤细胞----组织纤溶酶原活化剂
第二节 培养基的配制
• 1）培养基定义：
人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。
• 2）分类
• 根据培养基的形态:固体培养基、半固体培养基、液体培 养基 • 固体培养基：平板培养基和斜面培养基 • 根据用途分：保藏培养基、种子培养基、生长培养基、发 酵培养基、产酶培养基
4动物细胞培养基
• 1）动物细胞培养基组分包括： • 氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素 和生长因子 • a）氨基酸：必需氨基酸（Lys、Phe、Leu、 Ile、Val、Met、His、Trp），谷氨酸和谷 氨酰胺作为碳源利用 • b）维生素：含血清的培养基，无需补充， 无血清培养基需加VB和VC • c）葡萄糖:提供碳源和能源，过多易产生乳 酸，不宜细胞生长
控制阻遏物的浓度
• 阻遏物是能够引起某些酶生物合成停在或减速进 行的物质，无机磷酸是碱性磷酸酶阻遏物 • 产物阻遏和分解代谢物阻遏 • 控制阻遏物浓度方法解除阻遏作用： 1）控制易分解碳源的浓度，以解除分解代谢物阻 遏；2）采用补料、分次流加碳源方法；3）添加 cAMP解除分解代谢物阻遏；4）减少末端代谢产 物浓度；5）添加末端产物结构类似物，以解除阻 遏
3植物细胞培养基
• 1）植物细胞培养基的特点： a）植物细胞生长和代谢需要大量无机盐 b）需要多种维生素和植物生长激素 c）氮源一般为无机氮源 d）碳源一般为蔗糖，浓度为2%--5%
• 2）常用的植物细胞培养基
• MS培养基 —植物细胞、组织、原生质体培养；特点：硝酸盐浓度
较其他高
• B5培养基 —木本植物的组织和细胞培养；特点铵盐浓度较低 • White培养基 —适用生根培养；特点：无机盐浓度低 • KM-8P培养基 —适用原生质体培养；特点：成分全面
• 3）无机盐 • 提供细胞生命活动所需的各种无机元素； 对细胞内外pH、氧化还原电位、渗透压起 调节作用 • 大量元素：K、Ca、Na、Mg、P、S、Cl • 微量元素：Cu、Mn、Zn、Co、I等
• 4）生长因子 • 包括:维生素、AA、嘌呤碱基、嘧啶碱基、 生长激素
2微生物培养基
• 碳源采用淀粉或其水解产物 • 氮源采用含有有机氮源和无机氮源的混合 氮源 • 无机盐和生长因子根据需要添加
• 根据培养细胞类型分：微生物培养基、植 物培养基、动物培养基 • 根据主要营养成分来源分：天然培养基、 合成培养基、半合成培养基
1培养基的基本组分
• 培养基的一般组成：C源、N源、水、无机 盐、生长因子 • 1）C源
• 提供细胞营养物质；为细胞提供能量来源；是代谢产物酶 的组成元素；在细胞代谢调节中起作用 • 要求：碳源来源充足，价格低廉，有利于发酵条件优化和 产物分离纯化 • 不同细胞对碳源要求不同：微生物常以淀粉或水解物为碳 源；植物细胞常以蔗糖为碳源；动物细胞常以谷氨酰胺或 谷氨酸为碳源 • C源对酶合成具有代谢调节功能，如-半乳糖苷酶的生产， 乳糖为碳源诱导，以葡萄糖为碳源具有分解代谢物阻遏作 用
调节通气量；调节氧的分压；调节汽液接触时间；调 节汽液接触面积；改变培养液的性质
第四节 微生物发酵产酶
第三节 微生物发酵产酶
一、产酶微生物的分离和选育
1.优良产酶菌种应具备的条件
（1）酶产量高
（2）易培养（生长速率高、营养要求低） （3）遗传性能稳定，不易退化 （4）易分离提纯 （5）安全可靠（不是致病菌）
• 1）微生物种类多，相对动植物具有极高的产酶能力，产 酶多样化 • 2）微生物生长周期短，繁殖快，培养条件简单，适于工 业规模生产，减低陈本 • 3）微生物具有较强的适应性和突变能力，便于诱变育种 和基因工程育种，获得高产菌株
常见的产酶微生物
• 1）大肠杆菌
• 胞内酶，经过细胞破碎分离得到 • 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、 -半乳糖苷 酶、DNA聚合酶、DNA连接酶
液体深层发酵
• 在液体培养基中接种微生物，通过通气搅 拌等条件，进行发酵，生产得到所需酶的 方法。 • 适用于各种微生物培养，同时动植物细胞 培养 • 优点：机械化程度高、酶的产率高，质量 稳定，产品回收率高
固定化细胞发酵
• 在固定化酶的技术上发展起来 • 细胞固定在水不溶性载体上，在一定空间 范围内进行细胞生命活动的方式 • 优点：细胞的密度大，产酶能力高，发酵 稳定性好，可反复连续使用，便于连续发 酵，利于连续自动化生产，便于产品的分 离纯化，提高产品质量
添加表面活性剂
• 细胞膜具有高度选择性，控制胞内外物质 的运输 • 表面活性剂可以增加细胞膜的通透性，利 于胞内酶分泌胞外 • 离子型和非离子型表面活性剂 • 非离子型—吐温 • 提高酶的产量，对酶的稳定性和催化性亦 有作用
• 10）红曲霉
• 淀粉酶、糖化酶、蛋白酶
• 11）啤酒酵母
• 啤酒和酒类生产 • 转化酶、丙酮酸脱羧酶
• 12假丝酵母
• 脂肪酶、尿酸酶、转化酶、醇脱氢酶
Hale Waihona Puke Baidu
2植物细胞
• 植物细胞培养主要用于:色素、药物、香精 和酶蛋白的生产 • 其中用于产酶的细胞 • 番木瓜细胞------木瓜蛋白酶 • 大蒜细胞----------超氧化物歧化酶 • 胡萝卜细胞-------糖苷酶
应 用 含 酪 蛋 白 的 培 养 基
4.产酶微生物优良菌种的选育 • • • 诱变育种 原生质体融合育种 基因工程育种
二.微生物发酵产酶方法
1.固体培养:特别适合于霉菌培养
2.液体培养:目前酶发酵生产的主要方式
3.固定化细胞 :需要特殊的固定化细胞反应器
4. 固定化原生质体
固体培养发酵
• 在固体或半固体培养基中，接种微生物， 在一定条件下进行发酵，已获得所需要酶 • 适用于霉菌的培养和发酵 • 优点：设备简单、操作方便，酶浓度高 • 缺点：劳动强度大，原材料利用率低，生 产周期长
• 5）米曲霉
• 糖化酶和蛋白酶活力强，传统酒曲和酱油曲 • 糖化酶和蛋白酶，还有氨基酰化酶，磷酸二酯酶，果胶酶
• 6）青霉菌
• 苯氧甲基青霉素酰化酶，果胶酶，纤维素酶
• 7）木霉
• 纤维素酶，纤维二糖酶
• 8）根霉
• 糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶
• 9）毛霉
• 淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、果胶酶
第三节 产酶工艺条件及其调节调控
保藏细胞
细胞活化
细胞扩大培养
原生质体
固定化细胞
固定化原生质体 产酶 培养基 分离纯化
原生质体 培养基
酶
产酶工艺条件的优化控制
• 1）细胞活化和扩大培养 • 菌种的保藏：斜面保藏、沙土管保藏、真 空冷冻保藏、液氮保藏等 • 细胞活化：由休眠的细胞恢复活性细胞 • 常需一级或数级扩大培养，获得足够的优 质细胞 • 种子培养应以细胞达到对数生长期为主 • 接种量：1%-10%
固定化原生质体技术
• 20世纪80年代发展 • 便于胞内酶的分离纯化
微生物酶的类型
1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、
纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的 大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞 内也能维持较低水平，受到的调节控制少。 2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶， 酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。
三 提高酶产量的措施
• • • • • • 选择优良的产酶细胞 发酵过程的条件优化控制 添加酶的诱导物 控制阻遏物的浓度 添加表面活性剂 添加产酶促进剂
三、提高酶产量的策略
（一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种
(1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株
(2)使阻遏型变为去阻遏型
选育营养缺陷型突变株
3. 产酶微生物的分离和筛选
1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品 2)富集培养: 投其所好，取其所抗 3)分离获得微生物的纯培养（pure culture）。 4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。 5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。
-淀粉酶的筛选
蛋白酶产生菌的获得方法
•解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株 •解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株
2. 基因工程育种
（二）条件控制 1. 添加诱导物
酶的底物类似物最有效。
2. 降低阻遏物浓度
除去终产物 产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖 分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富 添加一定量的cAMP
• 2）氮源 • 提供细胞组成成分；是细胞生成，繁殖， 酶的生产营养元素， • 有机氮源：各种蛋白质及水解产物 • 无机氮源：各种含氮的无机物，铵盐和硝 酸盐 • 不同细胞对氮源的要求：微生物（异养和 自养）可以利用有机和无机氮源；植物细 胞常利用无机氮源；动物细胞要求氨基酸 和蛋白胨有机氮源 • C/N对酶产量的影响
第三章 酶的生物合成法生产
酶的生物合成法生产
第三章 酶的生物合成法生产
• 酶的生物合成法生产是指，经过预先设计，通过人
工操作，利用微生物、植物及动物细胞的生命活动，获得所 需的酶的技术过程
• 酶的生物合成法分为：微生物发酵产酶、植 物细胞培养产酶、动物细胞培养产酶 • 基本过程：
选择优良的产酶细 胞 选择适宜的培养基中培养 选择适宜的培养条 件
所需的 酶
分离纯化技术
酶的发酵液
第一节 细胞的选择
• • • • • • 用于酶生产的细胞必须具备条件： 1）酶的产量高； 2）容易培养和管理； 3）产酶稳定性好； 4）利于酶的分离纯化； 5）安全可靠，无毒性。
大多数酶采用微生物发酵生产，部分采用 植物细胞和动物细胞
1产酶微生物
• 利用微生物产酶优势：
• 3）温度的调节控制 • 不同细胞有各自不同的最适生长温度 • 产酶的最适生长温度往往不同于细胞生长 的最适生长温度 • 要求不同阶段控制不同温度，细胞生长阶 段控制细胞生长的最适生长温度；产酶阶 段控制产酶的最适生长温度 • 采用热水升温，冷水降温
• • • • • • •
4）溶解氧的调节控制 溶解氧定义： 连续供养以保持培养基中溶解氧量恒定 KO2定义： Kd定义： 条件KO2 = Kd 调节溶氧的方法：
• 2）枯草芽孢杆菌
• 主要产生胞外酶，少量产生胞内酶（碱性磷酸酶） • 淀粉酶、蛋白酶、 -葡聚糖酶、碱性磷酸酶
• 3）链霉菌
• 葡萄糖异构酶、纤维素酶、碱性，中性蛋白酶、几丁质酶
• 4）黑曲霉
• 生产多种酶，可产胞内和胞外酶 • 糖化酶、 淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、过氧化 氢酶、脂肪酶、纤维素酶
3.添加表面活性剂
离子型 对细胞有毒害作用 表面活性剂 非离子型 Tween－80 增加细胞通透性 TritonX－100
4. 添加产酶促进剂
添加诱导物
• 诱导物定义 • 诱导物可以加速诱导酶的合成，提高酶合 成产量 • 不同酶有不同诱导物；一种诱导物可以诱 导同一酶系不同酶的生物合成；同一种酶 有多个诱导物 • 诱导物分类：酶的作用底物；酶的催化反 应产物；底物类似物（效果最好）
2.常用的产酶微生物
Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis Micrococcus Streptococcus Streptomyces Aspergillus niger Aspergillus oryzae Monascus Penicillium Trichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida
• 2）pH的调节控制
• a细胞最适生长pH：细菌为中性偏碱（ pH 6.5-8.0）；霉 菌和酵母为偏酸（ pH 4-6 ）；植物细胞为（ pH 5.25.8 ）；动物细胞（ pH 7.2-7.6 ） • b产酶最适pH和生长最适pH往往不同；产酶最适pH往往 是该酶的催化最适pH； • c控制培养基的pH变化可以调控酶的产量关系，如米曲霉 产蛋白酶，pH为酸性时产酸性蛋白酶， pH为中性时产中 性蛋白酶， pH为碱性时产碱性蛋白酶；黑曲霉产淀粉酶 和糖化酶 • d细胞在发酵培养过程中，培养基pH会发生变化，必须对 培养基的pH进行适当的控制和调节 • e方法：改变培养基的组分和比例；使用缓冲液稳定Ph;添 加适宜的稀酸和稀碱；