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第三章酶的生物合成法生产

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酶工程 第三章酶的发酵生产 第一节酶生物合成的基本理论

酶工程 第三章酶的发酵生产 第一节酶生物合成的基本理论
转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶 （转录酶）的作用下，生成RNA的过程。
第一节 酶生物合成的基本理论
转录时，RNA聚合酶首先结合到DNA的特定位点（启动基因）上，DNA的 双螺旋链部分解开，以其中一条链为模板，通过碱基互补方式结合进第一个 核苷三磷酸，然后随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋逐渐解开，按照模板上 的碱基顺序逐个加入与其互补的核苷三磷酸并聚合而生成多聚核苷酸链。在 RNA聚合酶后面生成的多聚核苷酸链立即与模板分开，DNA分子的两条链又重 新缠绕形成双螺旋。（图3-1）
第一节 酶生物合成的基本理论
三、酶生物合成的调节
如上所述，酶的生物合成要经过一系列的步骤，需要 诸多因素的参与。故此，在转录和翻译过程中，许多因素 都会影响酶的生物合成。那么，究竟哪些因素对酶的生物 合成起主要的调节控制作用呢？研究结果表明，至少在原 核生物中，甚至在所有生物中，转录水平的调节控制对酶 的生物合成是至为重要的。
的过程,称为酶生物合成的诱导作用。简称为诱导作用。 起诱导作用的物质，称为诱导剂。例如，乳糖诱导β—半 乳糖苷酶的合成等。
酶生物合成的诱导作用过程如图3-4所示。
第一节 酶生物合成的基本理论
第一节 酶生物合成的基本理论
(B)
图3-4酶生物合成的诱导作用 （A）-----无诱导物时 （B）----添加诱导物时
转录水平调节控制，又称为基因的调节控制。这种控 制理论最早是由雅各（Jacob）和莫诺德(Monod)于1960年 提出的操纵子学说来阐明的，1966年发现了启动基因，使 这一调节控制理论不断完善。
第一节 酶生物合成的基本理论
根据基因调节控制理论，在DNA分子中，与酶生物合 成有密切关系的基因有4种。它们是调节基因(Regulator gene)、启动基因(Promoter gene)、操纵基因(Operator gene)和结构基因(Strutural gene)。其中，结构基因与 酶有各自的对应关系，结构基因中的遗传信息可转录成 mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链。操纵 基因可以特异性地与调节基因产生的边构蛋白（阻抑蛋白） 中的一种结构结合，从而操纵酶合成的时机及速度。结构 基因与操纵基因一起称为操纵子。启动基因决定酶的合成 能否开始，启动基因由两个位点组成，一个是RNA聚合酶 的结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMP）与环腺苷酸接受 蛋白（CRP）的复合物（cAMP- CRP）的结合位点。只有在 cAMP- CRP复合物结合到启动基因的位点上时，RNA

酶的生物合成

酶的生物合成

生产酪氨酸脱羧酶、链激酶、链道酶、双链酶等(有溶解血栓、血 块，加速伤口愈合等作用)
产生葡萄糖异构酶
.
8
2、 放线菌
菌种
(1) 链霉菌属
(Streptomyces)
委内瑞拉链霉菌 (S. venezulae)
灰色链霉菌 (S. griseus) 白色链霉菌 (S. albus)
不产色素链霉菌 (S. achromogenes)
(4) 透明质酸酶
治疗关节损伤、关节周围炎症及膝外伤，传染性肝炎及肝硬 化等
用做药物扩散剂
.
22
四、 产酶微生物的来源
1、土壤中的产酶微生物 2、水体中的产酶微生物 3、空气中的产酶微生物 4、极端环境中的产酶土壤是微生物生活的大本营，为微生物生长繁 殖及生命活动提供了各种条件
用于分析组成和杂质浓度的分析方法的细节
酶或微生物的毒理数据
微生物必须是非致病性的 微生物一定不能产生真菌素或其他毒性化合物 微生物一定不能产生抗生素
.
33
二、 微生物酶的发酵生产
1、酶的发酵生产方法 2、培养基的配制 3、种子培养 4、微生物发酵产酶的一般工艺
.
34
1、 酶的发酵生产方法
(1) 固体培养法 (2) 液体培养法
酶)
.
13
4、 霉菌
菌种 (4) 青霉(Penicillium)
酶及功能
点青霉 (P. notatum) 产紫青霉 (P. ururogenum)
产黄青霉 (P. chrysogenum)
橘青霉 (P. citrinum)
(5) 犁头霉(Absidia)
葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶，中性、碱性蛋白酶和青霉素V酰化酶 5’-磷酸二脂酶(水解RNA，生产4种5’-单核苷酸，肌苷酸和鸟苷

第三章 酶的生物合成

第三章 酶的生物合成
溶解氧：通气量越大、氧分压越高、气液接触 时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越 大。此外，培养液的性质，主要是粘度、气泡 以及温度等对溶氧速率有明显的影响，可通过 以上方面调节溶氧速率。
溶氧量过低，会对微生物生长、繁殖和新陈代 谢产生影响，从而使酶产量降低。但，过高的 溶氧量对酶的发酵生产业会产生不利影响，一 方面会造成浪费，另一方面高溶氧也会抑制某 些酶的生物合成，因此在整个发酵过程中应根 据需要控制好溶氧量。.
酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节， 在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的 调节控制机制，其中，转录水平的调控占主 导地位，是酶生物合成中最重要的调节
.
操纵子
操纵子（operon）是一组功能上相关且受同 一调控区控制的基因组成的遗传单位
操纵子是酶合成调控的结构基础
.
操纵子调控模型
根据基因调节理论，在 DNA 分子中，与酶的生物 合成有密切关系的基因有 4 种。它们是调节基因 （regulator gene）、启动基因（promoter gene）、 操纵基因（operator gene）和结构基因（structural gene）。
蛋白酶
. 皮革脱毛
酶发酵生产菌种要求
产酶量高，具有生产应用价值 易培养，既能适应大生产粗放的营养和生产条
件，包括能利用廉价原料、对工艺条件要求不 苛刻 代谢速率高，发酵周期短 产酶稳定性好，菌种的生产性能不易退化，不 易感染噬菌体 安全可靠，要求菌种不是致病菌，其代谢物安 全无毒，在系统发育上与病原体无关 选用产胞外酶菌种，有. 利于酶的分离提取
.
发酵条件控制及对产酶的影响
温度：影响微生物生长和合成酶、影响酶合成 后的稳定性
pH:影响微生物体内各种酶活性，从而导致微生 物代谢途径发生变化；影响微生物形态和细胞 膜通的透性，从而影响微生物对培养基中营养 成分的吸收以及代谢产物的分泌；影响培养基 中某些营养物质的分解或中间产物的解离，从 而影响微生物对这些营养物质的利用

第三章酶的生产

第三章酶的生产
第三章酶的生产
2023年5月15日星期一
第三章 酶的生产制备
酶的生产方式
1.提取法: 植物、动物、微生物
2.化学合成法
生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶
。 1949年细菌发酵生产淀粉酶
上个世纪70年代以来利用植物细胞和 动物细胞培养技术生产酶。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
34
2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生 长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 35
3.部分生长偶联型（又称延续合成型）
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入 平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。
所对应的mRNA相当稳定。
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线 36
4. 非生长偶联型（又称滞后合成型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并 大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。
所对应的mRNA稳定性高。
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 37
总结：影响酶生物合成模式的主要因素
②发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除 反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳 氮源的使用，补料发酵）。
③降低产酶温度。
二、细胞生长动力学
微生物细胞生长的动力学方程：
Monod方程：
S－限制性基质浓度； μm—最大比生长速率； Ks —Monod常数

酶学与酶工程第三章酶生物合成学生

酶学与酶工程第三章酶生物合成学生
要有黑曲霉、米曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。 黑曲霉：黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，
丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
米曲霉：半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科， 曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉菌落生长快， 10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变 为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状， 一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢 子梗2mm左右。
链霉菌
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
3．酵母菌 酵母菌(yeast)是—类单细胞微生物，但不同于细菌，
属于真核微生物。
酿酒酵母 球拟酵母 假丝酵母
拟酵母
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
4. 霉菌 霉菌是一类丝状真菌，用于酶的发酵生产的霉菌主
二、产酶微生物的来源
1．土壤中的产酶微生物 2．水体中的产酶微生物 3．空气中的产酶微生物 4．极端环境中的产酶微生物
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
三、产酶微生物的分离和筛选
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
第三章 酶的生物合成
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生
第一节 微生物发酵产酶
微生物发酵产酶的优点： 1）微生物种类繁多； 2) 微生物生长周期短，繁育快； 3) 微生物易改造，可通过多种手段育种。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Sciences
一、产酶微生物的种类 用于酶的生产的细胞必须具备几个条件 (1)酶的产量高 (2) 容易培养和管理 (3) 产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染 (4) 利于酶的分离纯化 (5) 安全可靠，无毒性

第三章第一节酶生物合成的调节PPT课件

第三章第一节酶生物合成的调节PPT课件

AUG
反密码
GUU UAC ACA
5’
3’ mRNA
密码(codon)与反密码(anticodon) 的碱基配对
.
31
蛋白质合成的几个要素-核糖体，ribosome
• 核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组成。 是存在于细胞质内的微小颗粒。
.
32
The ribosome composition of
.
Few example
2
一、提取分离法
• 酶的提取：在一定的条件下，用适当的溶剂处理 含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。
• 主要提取方法：
– 盐溶液提取
– 酸溶液提取
– 碱溶液提取
– 有机溶剂提取等
注意选择适当 的溶剂！！！
.
3
• 优点：提取方法简单方便 • 缺点：
– 必须先获得含酶组织或细胞 – 受气候环境影响 – 若培养细胞则工艺路线变复杂 – 产品含杂质较多，分离纯化较困难
.
4
适用范围
• 在动植物资源丰富的地区 • 从动物胰脏中提取各种胰蛋白酶，小肠中
提取碱性磷酸酶
.
5
二、生物合成法（发酵法）
• 利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的 生命活动而获得人们所需酶的技术。
依细胞 种类不同
微生物 植物细胞 动物细胞
发酵产酶 培养产酶 培养产酶
.
6
• 酶的发酵生产：经过预先设计，通过
60年代中期，在操纵子中还发现了另一个开关基因，称为启动基因。启
动基因位于操纵基因之前，二者紧密相邻。启动基因由环腺苷酸（cAMP）启 动，而环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。这样，葡萄糖便通过抑制环腺苷酸而间 接抑制启动基因，使结构基因失活，停止合成半乳糖苷酶。

第三章酶的发酵生产

第三章酶的发酵生产

CAP结合位点
DNA
P
O
Z
Y
A
+ + + + 转录
无葡萄糖，cAMP浓度高时
CAP CAP CAP CAP
CAP CAP
CAP
有葡萄糖，cAMP浓度低时
低半乳糖时
葡萄糖低 cAMP浓度高
高半乳糖时
RNA-pol
O Ｉ
无转录
O
mRNA
葡萄糖高 cAMP浓度低
Ｉ O
无转录
O
低水平转录
色氨酸操纵子——阻遏型操纵子 调节区
UUUU…… UUUU……
4
trp 密码子 前导肽
序列3、4不能形成衰减子结构 •当色氨酸浓度低时
细胞周期与酶的合成
可能的三种模式：
合成伴着生长进行，
进入静止期，合成降
低 静止期合成增加
中间类型
对数生长期合成降低，
三、酶发酵动力学
主要研究在发酵过程中细胞生长速率，产物 形成速率以及环境因素对速率的影响. 在酶的发酵生产中,研究酶发酵动力学对于了 解酶生物合成模式；发酵条件的优化控制,提 高酶产量具有重要的理论指导意义。
影响酶生物合成模式的因素主要是: mRNA和培养基中存的阻遏物：

mRNA稳定性高的，在细胞停止生长后继续合成相应的酶； mRNA稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成；
不受阻遏物阻遏的,可随着细胞生长而开始酶的合成；
受阻遏物阻遏的,要在细胞生长一段时间或进入稳定期后解除 阻遏,才能开始酶的合成。
2.人工合成酶制剂：

蛋白质的人工合成：人 工合成胰岛素等

人工合成酶制剂受客观
条件的限制，如试剂、 设备等，另外，体外合 成，形成单体的难度大，

第三章 酶的发酵生产

第三章 酶的发酵生产

五、温度的调节控制
1、温度对酶的发酵生产的影响
在发酵初期，细胞吸收营养物质合成自身物质和酶， 吸热反应，培养基中的营养物质被大量分解释放热 反应，但此时吸热反应大于放热反应，培养基需升 温；
当细胞繁殖迅速时，情况相反，需降温维持细胞生 产繁殖和产酶所需的最适的温度。
细胞（微生物）生产繁殖和产酶的最适温度随菌种 和酶的性质不同而异，并且生长繁殖和产酶的最适 温度往往不一致。 一般，细菌为37℃，霉菌和放线菌为28～30℃， 一些嗜温微生物需在40～50℃生长繁殖， 如：红曲霉的生长温度为35℃～37℃，而产糖化 酶的最适温度为37 ℃～40 ℃。
1、划线分离法
将样品制备适当的稀释液，用接种环蘸取样品 稀释液在培养基平板上分区划线分离，然后培养直 至单个菌落出现。
2、稀释分离法
五、菌株产酶性能鉴定
1、平板透明水解圈法
透明圈直径与产酶的关系： lg[E] / D=k· △[C] / lgt R/r·
其中：
[E] ：产酶浓度； D：菌体量； R：水解圈； r：菌落直径；△：琼脂厚度；[C] ：底物浓度； t：培养时间； k：常数。
（一）固体培养发酵（传统的方法）
一般适合于真菌发酵。
（二）液体深层发酵：
①适用性强，可用于各种细胞的悬浮培养和发酵。 ②易于人为控制。 ③机械化程度高，酶产品质量好，酶产率及回收 率较高。
（三）固定化细胞发酵（70年代后期）
1、优点：重复使用、易于分离、易于机械化、 抗逆性强、效率高。 2、缺点：产品质量不够稳定、易受传质和氧 的限制。
4、滞后合成型
只有当细胞生长进入平衡期后，酶才开始合成并大 量积累。许多水解酶类属于此类。 它们在细胞对数期 不合成，可能是受 到分解代谢产物的 阻遏作用，当阻遏 解除后，酶开始合 成，其对应的 mRNA稳定性高。

酶工程

酶工程
同步合成型：提高其对应的mRNA的稳定性，适当降低发酵 温度是可取的措施；
滞后合成型：设法降低培养基中阻遏物的浓度 ，尽量减少甚 至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶 的生物合成提早开始；
中期合成型：在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下 功夫，使其生物合成的开始时间提前， 并尽量 延迟其生物合成停止的时间。
生长因子：细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。
二、微生物培养基
碳源：淀粉或其水解产物 氮源：混合氮源
三、植物细胞培养基
特点：需要大量的无机盐；需要多种维生素和植物生长激素； 一般要求无机氮源；一般以蔗糖为碳源。
常用的培养基：MS培养基、B5培养基、White培养基、KM-8P培养基等。
配制方法：先配制母液； 大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、微生素 母液、植物激素母液。
第三节 产酶工艺条件及其调节控制
保藏细胞
原生质体
细胞活化 细胞扩大培养
固定化细胞
固定化原生质体
培养基
产酶
分离纯化
预培养
无菌空气
酶
图3-1 酶生产的工艺流程
一、细胞活化与扩大培养
将保藏的细胞接种于新鲜的培养基上，在一定的条件下进行 培养，使细胞的生命活性得以恢复的过程。
条件：适合细胞生长、繁殖的最适条件
四、固定化微生物细胞发酵产酶
固定化细胞：采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范 围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。
（一）固定化细胞发酵产酶的特点
提高产酶率 可以反复使用或连续使用较长时间 稳定性好 缩短发酵周期，提高设备利用率 产品容易分离纯化 适用于胞外酶等胞外产物的生产
（二）固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制
同，进行光照的调节控制； 前体的添加：目的代谢物代谢途径上游的物质。 刺激剂的应用：常用的刺激剂有微生物细胞的碎片和果胶酶、

03 第三章 酶的发酵生产1思维导图

03 第三章 酶的发酵生产1思维导图

第三章 酶的发酵生产-1微生物发酵产酶动植物细胞与微生物细胞比较体积剪切敏感性生长速率营养要求产物动植物细胞中酶生物合成的调节细胞分化基因扩增增强子抗体酶植物细胞的全能性植物细胞产酶种类植物细胞产酶优势与缺点提高目标产物产率缩短生产周期易于管理，减轻劳动强度提高产物质量培养条件要求高生长缓慢植物细胞培养流程外植体细胞获取细胞培养分离纯化获得产物植物细胞培养工艺条件控制培养基：水、无机成分、有机成分温度：室温范围pH：微酸性溶解氧：需氧量不高光照：需要刺激剂：细胞壁碎片、胞外酶动物细胞产酶动物细胞培养流程种质细胞悬浮细胞悬浮或贴壁培养收集培养液、分离纯化动物细胞培养特点生产功能性蛋白质生长缓慢容易受污染对剪切力敏感大部分具有锚地依赖性培养基成分复杂细胞生命有限动物细胞培养方式悬浮培养贴壁培养动物细胞培养基成分氨基酸维生素无机盐微量元素葡萄糖激素生长因子动物细胞培养工艺温度：36.5℃渗透压：等渗状态溶解氧：适量pH：7.0-7.6CO2: 2%-10%产酶微生物的获取工业上对产酶菌的要求非致病菌，不产生毒素遗传性质稳定蛋白酶活性低目标酶的产量高培养成本低获取产酶微生物的途径从自然界直接筛选获得从相关产品中进行分离对野生菌株进行选育购买使用权产酶微生物的保藏斜面冰箱保藏法沙土管保藏法菌丝速冻法石蜡油封存法冷冻干燥保藏法液氮保藏法微生物的培养方法固态发酵法液态发酵法滚瓶培养固定化培养产酶微生物的鉴定一幅图一张表一棵树植物细胞产酶微生物产酶生物合成的模式同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型。

酶的生物合成与发酵生产

酶的生物合成与发酵生产
加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。 酶合成诱导的现象：
已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶； -半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。
实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞 内无上述三种酶合成；
（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有 上述三种酶合成；
（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。
A.有活性阻遏蛋白
调节基因
阻遏蛋白 (有活性) 启动基因 操纵基因
结构基因
阻遏蛋白阻挡操纵基因 结构基因不表达
B.有活性阻遏蛋白加诱导剂
mRNA 酶蛋白 诱导物 诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起 到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达
C.无活性阻遏蛋白
mRNA
阻遏蛋白(无活性)
酶蛋白 阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达
体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。
色氨酸操纵子——酶的阻遏
结构基因 调节基因 操纵基因 调节基因
操纵基因
结构基因
mRNA 酶蛋白
辅阻遏物
代谢产物与阻遏蛋白结 阻遏蛋白不能与操纵基因结合， 合，使之构象发生变化 与操纵基因结合，结构基 结构基因表达 因不能表达
酶 的 诱 导 和 阻 遏 操 纵 子 模 型
有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点 （2）cAMP-CAP的结合位点。 CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA 聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才 能开始。 P S DNA O R

酶生物合成的基本理论

酶生物合成的基本理论
（1）双链RNA：在某些RNA病毒中，作为遗传信息的载体。
（2）tRNA: 在蛋白质的生物合成过程中，tRNA作为氨基酸载体，并 由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；
（ 3 ）催化活性 RNA： 属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关 的生化反应。 （4）sRNA：各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作 用。 （5） mRNA：携带遗传信息，在蛋白质合成时充当模板的RNA。 （ 6 ） rRNA ：是细胞中含量最多的 RNA ，约占 RNA 总量的 82% 。 rRNA单独存在时不执行其功能，它与多种蛋白质结合成核糖体， 作为蛋白质生物合成的“装配机”。
转录过程
起始位点的识别 recognition 转录起始 initiation 链的延伸 elongation 转录终止 termination 转录后加工 modification
2018/11/25
11
湖州师范学院 Ming
RNA合成过程
起始 双链DNA 局部解开 磷酸二酯 键形成
中心法则
Reverse transcription
2018/11/25
4
湖州师范学院 Ming
中心法则
Replication 复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下， 生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 Transcription 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将
其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的
2018/11/25 13 湖州师范学院 Ming
转录的主要过程（以大肠杆菌为例）
二、RNA链的延伸 1 、从起始阶段到延伸阶段， RNA 聚合酶 分子的构象发生变化。 2、RNA链的延伸沿着5’至3’的方向进行。 延伸的速率大约为50 nt/s. 3 、 RNA 聚合酶不具有外切核酸酶的活性， 无校对功能， RNA生物合成的差错率为 10-4-10-5，比DNA复制的差错率10-9-10-10 大的多。
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• 10）红曲霉
• 淀粉酶、糖化酶、蛋白酶
• 11）啤酒酵母
• 啤酒和酒类生产 • 转化酶、丙酮酸脱羧酶
• 12假丝酵母
• 脂肪酶、尿酸酶、转化酶、醇脱氢酶
2植物细胞
• 植物细胞培养主要用于:色素、药物、香精 和酶蛋白的生产 • 其中用于产酶的细胞 • 番木瓜细胞------木瓜蛋白酶 • 大蒜细胞----------超氧化物歧化酶 • 胡萝卜细胞-------糖苷酶
•解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株 •解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株
2. 基因工程育种
（二）条件控制 1. 添加诱导物
酶的底物类似物最有效。
2. 降低阻遏物浓度
除去终产物 产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖 分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富 添加一定量的cAMP
固定化原生质体技术
• 20世纪80年代发展 • 便于胞内酶的分离纯化
微生物酶的类型
1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、
纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的 大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞 内也能维持较低水平，受到的调节控制少。 2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶， 酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。
所需的 酶
分离纯化技术
酶的发酵液
第一节 细胞的选择
• • • • • • 用于酶生产的细胞必须具备条件： 1）酶的产量高； 2）容易培养和管理； 3）产酶稳定性好； 4）利于酶的分离纯化； 5）安全可靠，无毒性。
大多数酶采用微生物发酵生产，部分采用 植物细胞和动物细胞
1产酶微生物
• 利用微生物产酶优势：
4动物细胞培养基
• 1）动物细胞培养基组分包括： • 氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素 和生长因子 • a）氨基酸：必需氨基酸（Lys、Phe、Leu、 Ile、Val、Met、His、Trp），谷氨酸和谷 氨酰胺作为碳源利用 • b）维生素：含血清的培养基，无需补充， 无血清培养基需加VB和VC • c）葡萄糖:提供碳源和能源，过多易产生乳 酸，不宜细胞生长
添加表面活性剂
• 细胞膜具有高度选择性，控制胞内外物质 的运输 • 表面活性剂可以增加细胞膜的通透性，利 于胞内酶分泌胞外 • 离子型和非离子型表面活性剂 • 非离子型—吐温 • 提高酶的产量，对酶的稳定性和催化性亦 有作用
• 2）pH的调节控制
• a细胞最适生长pH：细菌为中性偏碱（ pH 6.5-8.0）；霉 菌和酵母为偏酸（ pH 4-6 ）；植物细胞为（ pH 5.25.8 ）；动物细胞（ pH 7.2-7.6 ） • b产酶最适pH和生长最适pH往往不同；产酶最适pH往往 是该酶的催化最适pH； • c控制培养基的pH变化可以调控酶的产量关系，如米曲霉 产蛋白酶，pH为酸性时产酸性蛋白酶， pH为中性时产中 性蛋白酶， pH为碱性时产碱性蛋白酶；黑曲霉产淀粉酶 和糖化酶 • d细胞在发酵培养过程中，培养基pH会发生变化，必须对 培养基的pH进行适当的控制和调节 • e方法：改变培养基的组分和比例；使用缓冲液稳定Ph;添 加适宜的稀酸和稀碱；
• 5）米曲霉
• 糖化酶和蛋白酶活力强，传统酒曲和酱油曲 • 糖化酶和蛋白酶，还有氨基酰化酶，磷酸二酯酶，果胶酶
• 6）青霉菌
• 苯氧甲基青霉素酰化酶，果胶酶，纤维素酶
• 7）木霉
• 纤维素酶，纤维二糖酶
• 8）根霉
• 糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶
• 9）毛霉
• 淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、果胶酶
液体深层发酵
• 在液体培养基中接种微生物，通过通气搅 拌等条件，进行发酵，生产得到所需酶的 方法。 • 适用于各种微生物培养，同时动植物细胞 培养 • 优点：机械化程度高、酶的产率高，质量 稳定，产品回收率高
固定化细胞发酵
• 在固定化酶的技术上发展起来 • 细胞固定在水不溶性载体上，在一定空间 范围内进行细胞生命活动的方式 • 优点：细胞的密度大，产酶能力高，发酵 稳定性好，可反复连续使用，便于连续发 酵，利于连续自动化生产，便于产品的分 离纯化，提高产品质量
3动物 细胞
• 动物细胞培养主要用于疫苗、抗体、激素、 多肽、酶的生产 • 人黑色素瘤细胞----组织纤溶酶原活化剂
第二节 培养基的配制
• 1）培养基定义：
人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。
• 2）分类
• 根据培养基的形态:固体培养基、半固体培养基、液体培 养基 • 固体培养基：平板培养基和斜面培养基 • 根据用途分：保藏培养基、种子培养基、生长培养基、发 酵培养基、产酶培养基
2.常用的产酶微生物
Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis Micrococcus Streptococcus Streptomyces Aspergillus niger Aspergillus oryzae Monascus Penicillium Trichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida
3. 产酶微生物的分离和筛选
1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品 2)富集培养: 投其所好，取其所抗 3)分离获得微生物的纯培养（pure culture）。 4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。 5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。
-淀粉酶的筛选
蛋白酶产生菌的获得方法
应 用 含 酪 蛋 白 的 培 养 基
4.产酶微生物优良菌种的选育 • • • 诱变育种 原生质体融合育种 基因工程育种
二.微生物发酵产酶方法
1.固体培养:特别适合于霉菌培养
2.液体培养:目前酶发酵生产的主要方式
3.固定化细胞 :需要特殊的固定化细胞反应器
4. 固定化原生质体
固体培养发酵
• 在固体或半固体培养基中，接种微生物， 在一定条件下进行发酵，已获得所需要酶 • 适用于霉菌的培养和发酵 • 优点：设备简单、操作
• 3）温度的调节控制 • 不同细胞有各自不同的最适生长温度 • 产酶的最适生长温度往往不同于细胞生长 的最适生长温度 • 要求不同阶段控制不同温度，细胞生长阶 段控制细胞生长的最适生长温度；产酶阶 段控制产酶的最适生长温度 • 采用热水升温，冷水降温
• • • • • • •
4）溶解氧的调节控制 溶解氧定义： 连续供养以保持培养基中溶解氧量恒定 KO2定义： Kd定义： 条件KO2 = Kd 调节溶氧的方法：
• 1）微生物种类多，相对动植物具有极高的产酶能力，产 酶多样化 • 2）微生物生长周期短，繁殖快，培养条件简单，适于工 业规模生产，减低陈本 • 3）微生物具有较强的适应性和突变能力，便于诱变育种 和基因工程育种，获得高产菌株
常见的产酶微生物
• 1）大肠杆菌
• 胞内酶，经过细胞破碎分离得到 • 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、 -半乳糖苷 酶、DNA聚合酶、DNA连接酶
控制阻遏物的浓度
• 阻遏物是能够引起某些酶生物合成停在或减速进 行的物质，无机磷酸是碱性磷酸酶阻遏物 • 产物阻遏和分解代谢物阻遏 • 控制阻遏物浓度方法解除阻遏作用： 1）控制易分解碳源的浓度，以解除分解代谢物阻 遏；2）采用补料、分次流加碳源方法；3）添加 cAMP解除分解代谢物阻遏；4）减少末端代谢产 物浓度；5）添加末端产物结构类似物，以解除阻 遏
第三章 酶的生物合成法生产
酶的生物合成法生产
第三章 酶的生物合成法生产
• 酶的生物合成法生产是指，经过预先设计，通过人
工操作，利用微生物、植物及动物细胞的生命活动，获得所 需的酶的技术过程
• 酶的生物合成法分为：微生物发酵产酶、植 物细胞培养产酶、动物细胞培养产酶 • 基本过程：
选择优良的产酶细 胞 选择适宜的培养基中培养 选择适宜的培养条 件
第三节 产酶工艺条件及其调节调控
保藏细胞
细胞活化
细胞扩大培养
原生质体
固定化细胞
固定化原生质体 产酶 培养基 分离纯化
原生质体 培养基
酶
产酶工艺条件的优化控制
• 1）细胞活化和扩大培养 • 菌种的保藏：斜面保藏、沙土管保藏、真 空冷冻保藏、液氮保藏等 • 细胞活化：由休眠的细胞恢复活性细胞 • 常需一级或数级扩大培养，获得足够的优 质细胞 • 种子培养应以细胞达到对数生长期为主 • 接种量：1%-10%
三 提高酶产量的措施
• • • • • • 选择优良的产酶细胞 发酵过程的条件优化控制 添加酶的诱导物 控制阻遏物的浓度 添加表面活性剂 添加产酶促进剂
三、提高酶产量的策略
（一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种
(1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株
(2)使阻遏型变为去阻遏型
选育营养缺陷型突变株
调节通气量；调节氧的分压；调节汽液接触时间；调 节汽液接触面积；改变培养液的性质
第四节 微生物发酵产酶
第三节 微生物发酵产酶
一、产酶微生物的分离和选育
1.优良产酶菌种应具备的条件
（1）酶产量高
（2）易培养（生长速率高、营养要求低） （3）遗传性能稳定，不易退化 （4）易分离提纯 （5）安全可靠（不是致病菌）
• 根据培养细胞类型分：微生物培养基、植 物培养基、动物培养基 • 根据主要营养成分来源分：天然培养基、 合成培养基、半合成培养基
1培养基的基本组分
• 培养基的一般组成：C源、N源、水、无机 盐、生长因子 • 1）C源
• 提供细胞营养物质；为细胞提供能量来源；是代谢产物酶 的组成元素；在细胞代谢调节中起作用 • 要求：碳源来源充足，价格低廉，有利于发酵条件优化和 产物分离纯化 • 不同细胞对碳源要求不同：微生物常以淀粉或水解物为碳 源；植物细胞常以蔗糖为碳源；动物细胞常以谷氨酰胺或 谷氨酸为碳源 • C源对酶合成具有代谢调节功能，如-半乳糖苷酶的生产， 乳糖为碳源诱导，以葡萄糖为碳源具有分解代谢物阻遏作 用