鸡蛋溶菌酶提取
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鸡蛋溶菌酶提取
溶菌酶(又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶)
是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活。
性质:
白色或微白色冻干粉,溶于水,不溶于乙醚和丙酮,pI为11.0-11.35,最适
pH值6.5。稳定性:酸性介质中可稳定存在,碱性介质中易失活;96℃, pH值为3条件下,15min后活力保持87%。抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在281.5nm 处的吸光系数为26.4。通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌
作用:
溶菌酶的用途极为广泛,在医药上,可与血液中的病毒结合,阻止流感、腺病毒等的繁殖;能分解粘多糖,有利于脓汁、痰液的排出;能清除坏死组织、增进抗生素的药效以及促进肠道有益细菌如乳酸菌的繁殖等作用;另外,它与抗生素联合应用还可治疗支气管炎、肺炎、白喉、小儿急性肾炎等多种疾病。在食品上,卵清溶菌酶是无毒的蛋白质,能选择性地使目标微生物细胞壁溶解,而对其他物质无反应,人们利用它来代替有害健康的化学防腐剂(如苯甲酸及其钠盐),以达到保存食物的目的,是一种天然防腐剂;溶菌酶添加于牛乳,可使牛乳人乳化,提高了牛乳的营养价值。
提取工艺:
(一)鸡蛋清中提取溶菌酶
方法一——食盐盐析
一.材料:
原料:鸡蛋、NaOH、NaCl、丙酮、(市售溶菌酶粉剂)
仪器与设备:搅拌器(200-300r/min),离心机(4000r/min),抽滤机
二.工艺流程:
原料→ 清洗→ 去蛋壳→ 分离蛋清→ 搅拌→ 过滤→ 加盐→ 调节pH
值→ 结晶→ 干燥→ 成品→ 包装
三.实验步骤:
1选择新鲜鸡蛋,蛋清的pH值不能低于8.0,否则不能用。
2清洗:用水洗掉蛋壳表面的不洁之物。
3将鸡蛋的两端各敲一个小洞,使蛋清流出。
4用搅拌机搅拌,将蛋清搅拌稠度均匀即可,以不引起泡沫为宜,防止由于起泡引起蛋白质的泡沫变性,而影响溶菌酶活性及产率。
5过滤:用双层纱布将稠度均匀的蛋清过滤,滤除蛋清溶液中的脐带块及蛋壳等。
6加盐:按50:1的比例(NaCl:蛋清液),向蛋清液中加入NaCl细粉,边搅拌边加入促使NaCl细粉及时溶解,以避免NaCl沉于容器底部,而因局部浓度过高而产生大量的白色沉淀
7 结晶:用1mod/l的NaOH溶液调节PH为9.5-10.0,边搅拌边加,避免过碱引起蛋白质变性。于4℃条件下静置过夜,至结晶析出。为加速其结晶过程,可加入适量溶菌酶晶种(晶种制备:将市售溶菌酶粉剂配制成5%水溶液,每10mL 加入Nacl 0.5g,滴加1M NaOH溶液调pH值至9.5—10.0,置4℃冰箱中,结晶析出即成)。不加晶种两周左右结晶率最高,反之72—96h最高。
8结晶过滤或分离:用滤纸或尼龙布过滤,或用离心机离心10min,得到溶菌酶结晶。 9结晶洗涤:用丙酮将溶菌酶结晶洗涤数次(一般3次即可)。
10干燥:将溶菌酶结晶在常温或(50-60)℃条件下干燥制成成品,水分含量质量分数约为(2-3)%。
方法二——离子交换法
一.材料
原料与试剂:鲜鸡蛋(市售)、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、丙酮、724型阳离子交换树脂等,以上药品均为分析纯。
主要仪器:分光光度计(7230G型)、搅拌器(200~300rpm)、离心机(4000rpm)。
二.工艺流程
三.实验步骤
1蛋黄与蛋清的分离。取新鲜的鸡蛋,去壳,经分离器后,使蛋清与蛋黄分离。打破蛋壳时应避免蛋黄破散,使两者完全分离。
2蛋清的预处理。将分离后的蛋清加入到搅拌器中,200-300 rpm下搅拌10min,再将蛋清搅拌稠度均匀即可,以不引起发泡为宜。最后用2-3层纱布过滤,以除去残余蛋壳和少量蛋黄。
3吸附。将过滤后的蛋清冷至5℃后移入搪瓷捅中,然后在搅拌下加入已处理好的树脂(14%加入),使其悬浮在蛋清中,在0~5℃下,搅拌吸附5h,然后在0-6℃静置20h以上,等分层后,弃去上清液后的树脂用清水反复冲洗2-3次。以除去杂蛋白,最后晾干树脂,移入一个搪瓷缸中。
4酶的洗脱。在上述树脂中加入同体积的0.15 mol/L的pH 6.5磷酸盐缓冲液,搅拌洗脱20min,过滤洗脱液,除去一部分杂质。再重复洗脱2次。将除去杂质的树脂加入等量浓度为10%的硫酸铵溶液,搅拌洗脱 30min,滤出洗脱液,重复洗脱3次,滤出的洗脱液一起倒入沉淀缸中沉淀。
5沉淀。在沉淀缸中按洗脱液的体积加入32%固体硫酸铵,搅拌使其溶解,在4℃放置过夜。第2天,用虹吸法取出上清,4000rpm离心10min分离沉淀物。
6透析。将沉淀物用蒸馏水全部溶解,然后放入透析袋中,在10℃水中透析过夜,以除去沉淀中的硫酸铵。收集透析液。
7盐析。将透析液移入一容器内,用0.1mol/L的NaOH调溶液pH至8.5~9.0,有白色沉淀时,应立即离心除去沉淀。用2mol/L HCl调pH至3.5,搅拌,并在0℃放置48h,同上离心收集沉淀物。
8成品的干燥。将上述沉淀物加入到丙酮,搅拌。放置2h,收集沉淀,用冷冻干燥法干燥沉淀即得产品。干燥的溶菌酶可在室温下长期保存。其纯品为白色或微黄色的结晶体或粉末,无臭,味甜,易溶于水,不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。
方法三——离子交换法
一.实验材料
鸡蛋(新鲜)磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、氯化钠、丙酮、硫酸铵、724 型阳离子交换树脂等。
二.工艺流程
硫酸洗脱
蒸馏水,溶解
pH=3.5,固体NaCl
盐析
三.实验步骤