香菜黄酮的乙醇回流与超声波辅助提取工艺对比研究摘要:为确定香菜(Coriandrum sativum L.)黄酮类物质提取工艺,采用热回流提取法和超声波辅助提取法,研究了不同影响因素对香菜干叶(粉)中黄酮类物质提取量的影响规律,并对经正交试验得到的两种最佳提取工艺进行了比较｡研究结果表明,乙醇浓度和液料比是影响提取量的主要因素,其次是提取温度(或超声振幅)和提取时间｡最佳工艺参数为60%乙醇,液料比25∶1(V/m,mL∶g),80℃热回流提取3 h;或70%乙醇,液料比25∶1,13 μm振幅超声波辅助提取45 min,预浸泡处理可提高超声波辅助提取量,经过预浸泡处理的超声波辅助提取达到与热回流提取一致的提取量,6.914 mg/g｡关键词:香菜;黄酮;热回流;超声;提取Comparison of Hot Reflux and Ultrasonic-assisted Methods of Extracting Flavonoids from Coriandrum sativum L.Abstract: The optimum conditions of extracting flavonoids from dry powder of Coriandrum sativum L. were analyzed by comparing hot reflux method with ultrasonic extracting technology. The results revealed that the extractant concentration and liquid-solid ratio were major impact factors; while the extraction temperature (or ultrasonic amplitude) and extracting time-length were minor factors. According to orthogonal test, the optimal parameters were 25 mL/g of 60% alcohol solution, hot reflux extracting at 80℃for 3 h; or 25 mL/g of 70% alcohol solution, ultrasonic extracting with an amplitude of 13μm for 45min. The extracting efficiency of hot reflux and presoaking ultrasonic-assisted methods were both as high as 6.914 mg/g. Presoaking treatment could increase ultrasonic extraction efficiency; and ultrasonic-assisted extracting method was suited for industrialization due to its high efficiency and low cost.Key words: Coriandrum sativum L.; flavonoids; hot reflux; ultrasonic; extraction 香菜异名芫荽(Coriandrum sativum L.),是伞形科植物｡香菜不仅营养丰富,而且具有特殊的香味,常被用作菜肴的点缀和提味品,但仅食用嫩茎和鲜叶浪费较大,同时价格波动也影响到菜农收益,因此加强香菜副产品开发具有重要意义｡黄酮类化合物广泛存在于多种植物,例如伞形科､银杏科､芸香科､唇形科､豆科､菊科等,是许多中草药的有效成分,具有多种保健功效[1]｡筛选合适的提取方法是黄酮开发应用的基础｡目前,从植物组织提取生物黄酮已有很多研究,提取方法主要包括有机溶剂提取法､热水提取法､碱性稀醇或碱性水提取法､系统溶剂提取法､超滤法､超声波辅助提取法以及微波提取法[2-4]等,其中乙醇回流提取和超声波辅助提取被认为成本较低且得率相对较高｡不同研究者不同的试验体系黄酮提取率有很大差异,因此采用平行对比的正交试验体系优化提取工艺对于确定最佳工艺十分重要｡香菜黄酮提取研究表明[5],采用有机溶剂结合超声波辅助提取法可以获得比热回流法更高的提取量｡本研究在单因素试验的基础上,通过设计同一批次样品的两种方法的平行对比正交试验,探讨了其最佳提取工艺,为生产工艺选择提供参考｡1材料与方法新鲜香菜叶片于2009年12月采于长江大学西校区试验田,品种为紫花香菜｡将香菜茎叶清洗晾干,90℃烘箱烘干至恒重,粉碎磨粉过筛(40目)后密封保存备用｡每次用量2.5 g左右｡乙醇热回流提取方法参照文献[3]进行｡超声波辅助提取使用Soniprep 150型超声细胞破碎仪(日本Sanyo公司),使用中型探头(直径9 mm),通过水浴控制超声温度为16℃｡香菜总黄酮含量的测定采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[6]｡该法利用芦丁为标准品,通过分光光度法在510 nm比色测定,获得芦丁总黄酮含量(y)与吸光度(x)的回归方程｡具体操作为,取香菜提取液5.00 mL(ddH2O为对照),依次加入30%乙醇7.50 mL､5%亚硝酸钠0.75 mL摇匀､静置5 min,再加入10%硝酸铝0.75 mL 摇匀､静置5 min,加入4%氢氧化钠10.00 mL､30%乙醇定容至25.00 mL､静置10 min,取20.00 mL于6 000 r/min离p 2.1测定总黄酮含量的标准方程根据不同含量芦丁(0.0､0.2､0.4､0.6､0.8､1.0､1.2 mg)反应后得到的不同吸光度,获得芦丁总黄酮含量(y)与吸光度(x)的回归方程为y=2.390 0x+0.023 2,相关系数r=0.999 7,作为测定总黄酮含量的标准方程｡2.2香菜总黄酮两种提取方法的单因素试验热回流提取和超声波辅助提取的单因素试验结果如图1所示｡分别以去离子水､无水甲醇､无水乙醇､无水丙酮作为提取剂,液料比为20∶1,使用80℃回流提取3 h,或者使用12 μm的振幅超声波辅助提取40 min,结果均表明采用无水乙醇作为提取剂,其提取量较高｡使用不同浓度的乙醇为提取剂,在以上提取条件下乙醇浓度为70%时提取量最高｡当乙醇浓度大于70%时,提取量有所减少,这可能是某些脂溶性物质溶出增加､干扰因素随之增大的缘故｡使用70%的乙醇,在不同液料比条件下,80℃回流提取3 h或者使用12 μm的振幅超声波辅助提取40 min,结果均表明液料比从10∶1递增至25∶1时,其总黄酮提取量上升,在25∶1时达最高｡使用70%的乙醇和液料比为25∶1的条件,80℃热回流提取不同的时间(h),或者使用12 μm的振幅超声波辅助提取不同的时间(min),结果表明在3 h之前,热回流提取量是在随之增加,超过3 h后又随之下降｡而超声波辅助提取量随着时间的加长逐渐增加,40 min前上升较快,在50 min后基本稳定｡使用以上单因素提取最佳条件,不同温度热回流提取的提取量在80℃出现峰值,继续升温提取量下降｡不同振幅超声波辅助提取50 min,结果说明随着振幅的增加,黄酮类物质的提取量呈上升趋势,当振幅达到13 μm时,上升趋势有所减缓｡2.3热回流提取香菜总黄酮的正交试验考虑到不同提取因素间可能相互作用,在热回流提取单因素试验基础上,选择L9(34)正交表设计乙醇浓度､液料比､提取时间和提取温度各3个水平正交试验,定量分析总黄酮提取量,其因素水平设置见表1,试验结果见表2｡从表2可以得出,影响热回流提取量的因素主次顺序依次为液料比>乙醇浓度>提取温度>提取时间｡4种因素的最佳组合是提取温度80℃,乙醇浓度为60%,液料比25∶1,提取时间3 h｡2.4超声波辅助提取香菜总黄酮的正交试验选择L9(34)正交表设计四因素三水平的正交超声波辅助提取平行试验,定量分析总黄酮提取量,其因素水平设置见表3,试验结果见表4｡表4表明,影响超声波辅助提取量的因素主次顺序为乙醇浓度>液料比>超声时间>振幅｡4种因素的最佳组合是振幅13 μm,乙醇浓度为70%,液料比25∶1,超声时间45 min｡2.5最佳提取工艺验证与优化由于两种提取方法的最佳工艺参数组合均不在正交试验的试验点以内,说明存在交互作用,需做验证试验｡验证试验结果如表5所示,使用最佳工艺参数,热回流提取量达6.992 mg/g,超声波辅助提取量达6.562 mg/g,均超过所有正交试验提取量,说明正交试验结果可靠｡考虑到热回流提取正交试验已包含不同热回流时间,因此可以不再考虑提取前的浸泡过程对提取量的影响,但是浸泡可能会影响超声波辅助提取的提取量,因此使用超声前浸泡2 h的处理进行对照测定,并与未浸泡的超声波辅助提取和热回流提取进行多重比较｡结果如表5所示｡多重比较结果说明,热回流提取量高于未提前浸泡的超声波辅助提取量,差异极显著,但是超声前的浸泡处理显著提高了超声波辅助提取量,达到6.914 mg/g,与热回流提取量水平基本一致｡3讨论目前关于不同材料来源黄酮提取的研究资料,仅少数对不同方法提取效率进行了对比研究[7-9]｡通过正交试验设计则可以从多因素多水平明确提取条件对提取效率的影响,特别是条件之间的互作效应,从而获得最佳工艺｡由于不同批次的材料和试验过程可能影响试验结果的有效性,因此设计平行对比的正交试验对不同提取方法的筛选具有重要意义｡目前在荸荠总黄酮不同提取方法的比较研究中获得较好的效果[10],但在其他材料的研究中鲜有应用｡从试验结果可以看出,如果不考虑超声波辅助提取前的浸泡过程,热回流提取量最高,这与闫斐艳等[7]在苦荞种子黄酮提取的研究结果一致｡但超声波辅助提取具有时间短的优点(约为热回流提取时间的1/4)｡在超声处理前,通过不消耗成本的浸泡预处理,提取量与热回流提取并无明显差异,提取量较高｡此外超声波辅助提取不增温,利于热敏成分提取,且成本低､污染较小,因此容易实现产业化｡两种提取方法比较还可以看出,液料比和乙醇浓度均是主要影响因素,而且因素间存在明显的互作,这与实际情况完全相符｡例如增加液料比有利于提取且可以减少提取时间｡目前黄酮类产品多数来自银杏叶,与银杏叶黄酮含量相比,香菜中可提取黄酮的含量虽略低,但香菜易种植易采收,种植周期短,香菜滞销时可全株提取黄酮,利于菜农增产增收,可见香菜黄酮具有较好的开发前景｡参考文献:[1] 古勇,李安明. 类黄酮生物活性的研究进展[J]. 应用与环境生物学报,2006,12(2):283-286.[2] 郑有飞,石春红,汪本友. 天然黄酮物质提取技术和分析方法的研究进展[J]. 分析科学学报,2009,25(1):102-107.[3] 郭雪峰,岳永德. 黄酮类化合物的提取､分离纯化和含量测定方法的研究进展[J]. 安徽农业科学,2007,35(26):8083-8086.[4] 张岩,曹国杰,张燕,等. 黄酮类化合物的提取以及检测方法的研究进展[J]. 食品研究与开发,2008,29(1):154-158.[5] 邵红,边才苗,杨蓓芬,等.香菜总黄酮的超声提取工艺研究[J]. 食品研究与开发,2005,26(5):89-91.[6] 蒋立科,杨婉身. 现代生物化学实验技术[M]. 北京: 中国农业出版社,2003. 191-193.[7] 闫斐艳,杨振煌,李玉英,等. 苦荞种子总黄酮提取方法的比较研究[J]. 食品与药品,2010,12(3):93-95.[8] 彭金年,李银保,程庚金生,等. 菟丝子总黄酮不同提取方法的比较[J]. 西北林学院学报,2010,25(2):140-142.[9] 周燕园,甄汉深,袁叶飞,等. 青天葵中两种黄酮提取工艺的正交实验优选[J]. 时珍国医国药,2009,20(8):1862-1863.[10] 黄利华,赵力超,张业辉,等. 荸荠总黄酮不同提取方法的比较研究[J]. 食品工业科技,2009,30(10):227-229.。
