生物化学实验技术

设计要求：
（1）蛋白质样品的选择: 乳制品、植物蛋白、动物蛋白等 （2）处理方法的选择：根据所要制备和测定的蛋白质样品
的来源、种类和特性选择处理的方法——可选择粉碎、匀 浆、超声破壁等方法 （3）制备方法的选择：根据要测定的蛋白质组分选择制备 的方法——要求必需选择一种蛋白质样品的制备方法，如 采用特定溶剂提取后测定特定溶解性的蛋白质、分离纯化 后测定特定组分的蛋白质或除去脂肪等杂质制备粗蛋白测 定蛋白质等等。
1.安装膜具
装封胶条，注意封胶条平面朝 下，不能有裂口
盖上凹玻璃
将凹玻璃冲外装进槽里
将楔子插进，将底部插紧
2. 配制凝胶溶液
胶的配制(平行电泳两块胶板)
胶母液： 8.4ml 配胶缓冲液：13ml 蒸馏水：4ml 10% TEMD： 0.2ml，混匀 10%AP： 0.2ml ，混匀
示意图（交换树脂表面）
示意图（离子交换过程）
电离基团（磺酸根） 可交换离子（钠离 子） 交换离子 阳离子交换树脂：可供交换的是阳离子；
阴离子交换树脂：可供交换的是阴离子；
不交换离子
示意图
B物质
水分子
A物质
三、操作步骤
1、装柱
¾ 装柱是最关键的一步。 ¾ 重力沉降法装柱 ¾ 陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面
-
-
-
-
1
三氯化铁浓盐酸溶液/mL
2
2
2
2
2
苔黑酚乙醇溶液/mL
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
放沸水浴中10-20min后 的现象
由于核酸和脱氧核糖核酸有特殊的颜 色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一 定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖 的量成正比。因此可用定糖法来定性定量 测定核酸。
上述两种定糖的方法准确性较差，但 快速简便，能鉴别DNA和RNA，是鉴定核 酸、核苷酸的常用方法。
3 实验记录与实验报告
3.2 实验报告 实验报告的格式应为：
⑴ 实验目的； ⑵ 实验原理； ⑶ 仪器、材料和试剂； ⑷ 实验步骤； ⑸ 结果讨论（含数理据处）； ⑹ 注意事项; (7)思考题 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有 关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化 学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析 和见解，并欢迎对实验提出改进意见。
蓝色物质
注意：DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干 扰作用。
按教材表1加入各种试剂，反应后观察并记录结果。
表1 二苯胺反应加入试剂
管号
1
2
3
4
5
蒸馏水/mL
1
-
-
-
-
DNA溶液/mL
-
1
-
-
-
RNA溶液/mL
-
-
1
-
-
提取物一/mL
-
-
-
1
-
提取物二/mL
-
-
-
-
1
二苯胺试剂/mL
2
2
2
2
2
放沸水浴中10min 后的现象
思考题：
1．比较几种方法的优点和缺点？ 2．为什么标准蛋白质必须用凯氏定氮法测定度？ 3．若样品中含有核酸杂质，紫外法测定时应如何
排除干扰？ 4. 说明你所选择的蛋白质样品、制备方法和蛋白
质含量测定方法的依据。
3. 灌胶，加到顶部，来回倾斜去气泡
插入梳子
凝胶
胶凝后用夹子将玻璃夹出
用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉
旋转180度，凹玻璃向里 将玻璃放进槽内 加缓冲液
4. 样品制备：
将0.5ml 样品
液，0.25ml 10% SDS 和0.25ml 1%巯基乙醇 于小试管中，置100℃ 水浴中煮沸3分钟后， 取出冷却，然后，加 入0.25ml 上样缓冲液 （0.05%溴酚兰+ 40% 蔗糖溶液），混合。 取出混合样品40微升 加入样品槽，每个样 品重复两个。
20mL95％乙醇＋海砂
菜花花冠
匀浆
20g
抽滤
20mL丙酮
滤渣
搅拌均匀 抽滤
滤渣
搅拌
抽滤
20mL95％乙醇
抽滤
滤渣
提取 物二
滤液
20mL高氯酸
滤渣
冰盐浴
20mL丙酮
搅拌5min 抽滤
滤渣
20mL丙酮
重复 一次
40mL10％ 氯化钠
滤渣
搅拌5min 抽滤至干
滤渣
抽滤
沸水浴
滤液
抽滤 20mL高氯酸
15min
根据以上选择制定实验方案，并确定 具体的实验参数，具体实验步骤和参数的 选择可参考实验教材。
第二部分：样品中蛋白质含量的测定
设计要求： （1）根据所制备的样品中蛋白质的性质选择合适的
测定方法，如粗制品的粗蛋白质含量和蛋白质含 量一般可选择凯氏定氮法，纯化后没有干扰的蛋 白质样品可选择紫外分光光度法等其它方法，标 准蛋白质为牛血清白蛋白。 （2）参考附录中提供的可选用的方法，制定测定的 具体实验方案。
一、实验目的
¾ 学习和掌握从植物组织中分离核酸的原理和方法 ¾ 掌握定糖法测定核酸的原理及操作方法
二、原理
核酸的提取：三氯乙酸或高氯酸除酸溶小分子 有机溶剂去脂类 浓盐溶液（10％NaCl）提DNA 0.5M高氯酸提RNA
RNA核糖的测定:苔黑酚法
DNA脱氧核糖的测定：二苯胺法
三、操作步骤
1、核酸的分离
¾ 阳离子交换树脂：可供交换的是阳离子； ¾ 阴离子交换树脂：可供交换的是阴离子；
z 常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联 剂：二乙烯苯）
z 阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基 z 阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 z 可交换离子：阳离子：Na+、H+
阴离子：Cl-、OH-
生物化学实验技术
Biochemical Experiment
绪论
1 实验目的
z 掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分 离、纯化和测定技术的原理及方法；
z 掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实 验技能；
z 培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学 作风、创新能力等综合素质。
2 通过生物化学实验应该做到
实验目的： 通过学习的生物化学知识和实验技术，学会
自行设计一种含蛋白质的样品处理方法、蛋白质 制备方法和测定方法。
基本要求：
掌握常用的蛋白质制备和定量测定的方 法及其原理，能够根据样品的种类不同设计 蛋白质制备的方法，并根据蛋白质性质不同 设计选用相应的定量测定方法。
培养目标：
通过实验方案设计及方法选择，使学生 了解不同来源蛋白质制备的基本原理与方 法；熟悉几种蛋白质含量测定方法的基本原 理及应用条件；学会设计并实施一种蛋白质 的制备及测定实验方案；通过实验独立完成 试剂的配制、蛋白质的制备、标准曲线的制 作、蛋白质含量测定、结果计算、方案实施 总结全过程。并能够熟练使用离心机、分光 光度计等进行蛋白质制备和紫外、可见分光 光度测定。
上有胶粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉 降至适当的柱床体积为止。 ¾ 柱的表面始终要保持着一层溶剂(一般l～3cm柱 高)柱的任何一部分绝对不能“流干”。
1、装柱
z 层析柱的形状，一般直径 与高度的比为l：15为宜。
z 柱形必须根据层析介质和 分离目的而定。待分离物 质的性质相近，柱越细长， 则分离效果越好，但流速 较慢。在样品组分并不复 杂的情况下，采用“矮胖 柱”。
RNA+浓盐酸+
OH
OH FeCl 3
绿色化合物
注意：DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干扰作用。
按教材表2加入各种试剂，反应后观察并记录结 果。
表2 苔黑酚反应加入试剂
管号
1
2
3
4
5
蒸馏水/mL
1
-
-
-
-
DNA溶液/mL
-
1
-
-
-
RNA溶液/mL
-
-
1
-
-
提取物一/mL
-
-
-
1
-
提取物二/mL
5. 加 样
6. 电泳
接通电源，电流 恒定为80mA，待溴酚 兰指示剂移至离下端 0.5cm（约3小时）， 切断电源，拔去插 头，倒出电极缓冲液 于大烧杯中（如此缓 冲液欲重用时，应把 正负电极液分别贮 存）。
7. 剥胶
8.染色： 考马斯亮蓝染色，详见教材
9.脱色
10. 凝胶（脱色之后）结果分析
z 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实 验的基本原理，学会严密地组织自己的实 验，合理地安排实验步骤和时间。
z 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种 生物化学实验仪器。
z 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技 能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清 洁地进行所有的实验。
z 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技 术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今 后参加科研工作打下坚实的基础。
3、加样
z 上样量：0.3-0.5mL
注意：
¾加样的同时开始收集 ¾加样时且勿搅动树脂床面
z 0.5mL缓冲液冲洗加样处2次
4、洗脱与收集
z 尽量维持衡定柱压
z 每2分钟收集一管，共收集25管
5、氨基酸的鉴定
每个收集管
＋
沸水浴15min
1mL水合茚三酮
比色测定
绘制洗脱曲线
实验二 SDS-PAGE分离蛋白质
根据现象分析提取物一和提取物二中主要 含有什么物质?为什么？
思考题：
1．核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物 质？本实验是怎样除掉的？
2．运用本实验方法是否可以制备得到高纯度核酸? 3．快速鉴别RNA和DNA的方法是什么?
实验四 设计性实验——蛋白质的制 备及其含量测定
实验类型： 给定选题的综合设计性实验
(1) 计算迁移率（Rm值）：计算公式见教材。 (2) 绘制标准曲线：以标准蛋白亚基的Rm值为横坐标，以相
应分子量的对数值为纵坐标，即可绘制出测定蛋白质分 子量的标准的线图。 (3) 计算未知蛋白亚基样品的分子量：根据未知样品样的Rm 值，从上述标准曲线图中即可查出其分子量。
实验三 菜花中核酸的分离与鉴定
70℃水浴20min
提取物一
2、RNA和DNA的定性鉴定
（1）二苯胺反应
测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧
核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热
后，产生蓝色。这是因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核
糖遇酸生成ω-羟基-6-酮基戊醛，再与二苯胺作用产
生Байду номын сангаас色物质。
DNA+少量浓硫酸或冰乙酸+ NH
4 实验成绩评分方法
实验预习情况（10%） 实验操作情况（20%） 实验报告情况（30%） 实验考试成绩（40%）
实验一 离子交换层析法分离氨基酸
一、实验目的 学习用阳离子交换树脂分离氨基酸 的操作方法和基本原理
二、原理 氨基酸的pI不同，在同一pH下所带电荷的
数量和性质不同，与树脂的亲和力就有差异， 因此可根据亲和力从小到大的顺序依次被洗脱 下来。
一、实验目的 掌握SDS-PAGE的工作原理和操作方法
二、原理 不同蛋白质具有不同的分子量，并在一定
的pH溶液中带有不同的电荷。但经过SDS处理 后的蛋白质，分子表面完全被负电荷所覆盖， 因此在电泳时，电泳迁移率近取决于蛋白质的 分子量大小而与其所带电荷的性质无关。 ¾ 分子筛效应 ¾ 浓缩效应
三、操作步骤
可选择的蛋白质含量测定方法有：
（一）紫外分光光度法 （二）Bradford法 （三）微量凯氏定氮法 （四）双缩脲法等 （五）Folin-酚法
实验报告：
要求给出实验目的、设计方案及设计原 理、实验技术路线和参数选择的依据、实验 参考文献、实验方法和步骤、实验结果和分 析、总结。
第一部分：蛋白质样品的选择、处理及制备
（2）苔黑酚反应
测定核糖的常用方法是苔黑酚法（3，5—二羟基甲
苯，即Orcinol反应）。当含有核糖的RNA与浓盐酸及3， 5—二羟基甲苯在沸水水浴中加热10～20min后，有绿色物 产生，这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛， 后者再与3，5—二羟基甲苯作用生成绿色物质。
CH3
100 o C
2、平衡
z 层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pH和离子强 度，一般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体 积相当于4-6倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳 定。装好的柱必须均匀，无纹路，不含气泡，柱顶交 换剂沉积表面十分平坦。
z 本实验平衡体积：60－80mL
z 调节流速：0.5mL/min或8-12滴/min
3 实验记录与实验报告
3.1 实验记录 实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。 实验中应及时准确地记录(专用纸，事先在记录纸上
设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测 量的数据。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为 “0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能 重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很 大，也都应如实记录，不得涂改。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、 编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、 试剂的浓度等。