拟南芥原生质体的提取和转化
(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于
20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；
(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时；
(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，
60g，离心15min；
(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；
(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；
(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬；
以下操作均在23℃下进行：
(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪
去前端）轻柔混匀；
(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；
(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；
(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；
(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：
cellulose R10 15%
Macerozyme R10 0.3%
Mannitol 1.09g
KCl 0.3M
MES 0.3M
调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液
CaCl20.15M
β-巯基乙醇0.75mM
(2)PEG溶液（40%，v/v）
PEG4000 1g
0.8M Mannitol 0.625ml
1M CaCl2 0.25m
(3)W5溶液
154mM NaCl 9.0g
125mM CaCl218.4g
5mM KCl 0.37g
5mM glucose 0.9g
0.03%MES 0.3g
用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液
1M MgCl20.5ml
0.1%MES 0.1g
0.4M Mannitol7.3g
用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌
