拟南芥原生质体制备转化操作流程
主要试剂
1. 纤维素酶解液：
试剂
15ml酶液体系
1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉
2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉
3．0.4M mannitol1.09g干粉
4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液
5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液
6．加入10ml 水
7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl2
9．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）
11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。
2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）
PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g
0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml
1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml
约1.2ml
3. W5 溶液（1000ml）
154mM NaCl, NaCl9g
125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g
5mM KCl, KCl0.37g
2mM MES（PH 5.7），MES0.39g
pH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
4. MMG溶液
MaMg溶液（500ml）
15mM MgCl2，MgCl0.71g
4 mM MES(PH5.7)MES0.39g
0.4 M mannitol，Mannitol36.5g
用KOH调pH 5.7，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
5. WI溶液
WI(200ml)
0.5M mannitol，mannitol18.217g
4mM MES,pH5.7，MES0.156g
20mM KCl，KCl0.12g
高温高压灭菌，室温保存。
实验步骤
1. 土培室播种种植拟南芥。
2. 生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。
3. 剪取中部生长良好的叶片用新的剃须刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。
4. 将切好叶条掷入预先配置好的酶解液（10ml的酶液用125ml 的三角瓶装）中（每5-10 ml 酶解液大约需10-20片叶子（小量））(100 -150 叶片需要40-60ml酶解液（大量）)。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
5. 用真空泵于黑暗中抽5-30分钟。
6. 或者将叶条至于培养皿中加入酶液放入真空干燥箱里，在黑暗中消化3个小时，此步需要根据你自己的实验经验，通常会延长孵育16-18h。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul枪头去尖使操作时吸打缓和。）（此时预冷一定量W5溶液）
7. 显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。
8. 在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。
9. 先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。
10. 用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体，如果回收率低可以提高转速或是加入CaCl2（50mM）。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体(电转化用预冷的W1)终浓度为1-2 x 105/ml。
11. 在冰上静至原生质体30分钟。(在有些实验中原生质体在使用前可以在室温终保存)
以下操作在室温23℃下进行
12. 100g离心1-3分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。
13. 加入10 ul DNA（10-20微克约5kb的质粒DNA）至2ml离心管中。
14. 加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。
15. 加入110 ul PEG/Ca溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。
16. 诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。
17. 室温下用440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。
18. 室温下用台式离心机100g离心1-3分钟然后去除上清，将原生质体轻轻吹打稀释至100ul。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。
19. 用1ml WI或者W5溶液轻柔重悬原生质体于六孔组织培养皿中。
20. 室温下（20-25℃）诱导原生质体18小时以上。
21. 激光共聚焦显微镜下观察GFP标签表达。（以上实验可以根据自己实验情况适当调整）
