ELISA原理及步骤

ELISA试验技术要点ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学技术，用于检测特定蛋白质或其他分子在样本中的存在量。

ELISA试验技术是基于抗原-抗体相互作用原理的一种快速、敏感的定量方法。

在本文中，我们将讨论ELISA试验技术的要点，包括原理、步骤、优缺点以及应用范围。

一、ELISA试验的原理ELISA试验通过测定受检物质与特定抗体之间的结合来检测受检物质的存在量。

ELISA试验通常包括4个基本步骤：涂底板、孵育、洗板和检测。

在涂底板过程中，将要检测的抗原或抗体固定在底板上。

然后，在孵育过程中，将待测样本加入底板，与固定的抗原或抗体结合。

接着，在洗板过程中，清洗掉未结合的物质。

最后，在检测过程中，使用酶标记的二抗或底物来确定结合的抗原和抗体的量。

二、ELISA试验的步骤1.涂底板：将抗原或抗体固定在底板上。

2.孵育：加入待检测样本，经过特定时间让抗原和抗体发生结合。

3.洗板：清洗掉未结合的物质，防止干扰物质的干扰。

4.检测：加入酶标记的二抗或底物，测量酶标记反应的信号强度。

三、ELISA试验的优缺点1.优点：ELISA试验具有高灵敏度和特异性，能够快速、准确地检测目标物质的存在量。

此外，ELISA试验的操作简单，不需要昂贵的设备。

2.缺点：ELISA试验在一定程度上受到干扰物质的影响，有时需要多步骤操作，容易出现误差。

四、ELISA试验的应用范围ELISA试验广泛应用于医学、生物化学、环境科学、食品安全等领域。

在医学领域，ELISA试验可用于诊断感染病原体、筛查肿瘤标志物等。

在生物化学领域，ELISA试验可用于研究蛋白质的相互作用、酶活性等。

在环境科学领域，ELISA试验可用于检测水体或土壤中的污染物。

在食品安全领域，ELISA试验可用于检测食品中的残留农药、重金属等。

总之，ELISA试验技术是一种重要的生物化学技术，具有广泛的应用价值。

ELISA完整详解(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。

即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

(简称洗涤，下同)。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于4 50nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D 值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。

elisa的检测原理及步骤ELISA也就是酶联免疫吸附法，是常见的一种免疫学实验技术，广泛应用于疾病诊断、药物检测和基因工程等多个领域。

下面对该检测方法的原理和步骤进行详细介绍。

一、原理ELISA是一种通过酶标记在特定抗原-抗体反应后，通过测定酶活性或者荧光强度来检测特定抗体或抗原的方法。

具体原理包括以下几个方面：1.抗体/抗原的孕育：为了进行ELISA检测，首先需要制备抗体或者抗原，在抗原的孕育过程中，一般采用细胞、细胞质、蛋白质、肝炎病毒核心抗原、抗体等作为抗原。

2.抗原加到板上：将抗原添加到检测板上，用于捕获待测样品中的特定抗体/抗原。

5.辣根过氧化物酶标记抗体加入：将与辣根过氧化物酶标记的抗体加入到检测板上，抗体与待测样品中的抗原结合。

6.底物加入：将底物（可以是苯基乙酸和过氧化物的混合物）加入到检测板上，通过酶标记抗体加强底物的催化，产生颜色。

7.读板：用酶标记抗体催化反应的底物生成的颜色强度，表示样品中的相应抗体或抗原的含量。

二、步骤ELISA步骤如下：1.制备捕获抗体：制备捕获抗体，将其吸附到检测板上。

2.将样品加入检测板：向检测板添加待测物质，例如蛋白质或者抗体。

3.洗涤步骤：用缓冲液冲洗检测板上的非特异性结合物质，以减少假阳性反应的出现。

4.加入探针抗体：加入与待测物质特异性结合的酶标记抗体。

6.底物加入：加入底物，让酶标记物质生成颜色。

7.读板：对反应所生成的颜色进行测量，例如比色法或者发光法等。

三、总结ELISA检测具有以下优点：非常准确、灵敏性高、易于操作、可产生准确可靠的结果等。

其通过测定酶活性成分的存在，展示了其在生物医学领域中的重要应用，帮助人们更好地理解生物分子，并依据该理解开展诸如疾病诊断、药物检测和基因工程等工作。

ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理：1.直接ELISA：直接将酶标记的抗体与待测样品中的抗原结合。

该方法简单，适用于检测高浓度抗原，但不适用于低浓度抗原检测。

2.间接ELISA：先将待测样品中的抗原与特异性抗体结合，随后再加入酶标记的二抗与该特异性抗体结合。

该方法适用于特异性抗体较多的情况，能够提高检测灵敏度。

3.夹心ELISA：利用两种抗体分别与待测样品中的抗原结合，形成夹心复合物。

酶标记抗体与第二个抗体结合的复合物逐渐积累，从而实现对目标分子的定量检测。

4.竞争ELISA：利用酶标记抗体与待测样品中的抗原竞争结合，根据酶标记物对底物的催化反应产生的信号强度来反映待测样品中抗原的浓度。

操作步骤：1.酶标板涂布：取出96孔的酶标板，在每孔中加入特异性抗体，通常用于检测的是抗原，也可以是抗体。

将酶标板在4°C下孵育数小时或过夜，使抗体吸附在孔壁上。

2.冲洗：倒掉孔内液，用PBS-T洗涤缓冲液冲洗3-4次，去除未结合的抗体。

3.阻断：加入阻断缓冲液如5％的牛血清白蛋白(BSA)或非脂乳粉，防止非特异性结合。

4.样品加入：加入待测样品、标准品或对照样品，使待测物质与固相抗体结合。

5.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的样品。

6.酶标记抗体：加入酶标记的二级抗体，即酶联检测剂。

7.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的酶标记抗体。

8.底物加入：加入底物，底物受到酶标记的物质的催化，会产生信号。

9.反应停止：加入反应停止液，终止底物的反应。

10.读取结果：通过酶催化底物反应的产物颜色的变化，利用酶标仪读取OD值，反映抗原或抗体的浓度。

ELISA方法的基本原理和操作步骤自己收藏的觉得很有用故上传到百度与大家一起分享！ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assayELISA）用于IgG定量测定的文章使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性又保留酶的活性在测定时把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例加入酶反应的底物后底物被酶催化变为有色产物产物的量与标本中受检物质的量直接相关故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析由于酶的催化频率很高故可极大地地放大反应效果从而使测定方法达到很高的敏感度方法类型和操作步骤ELISA可用于测定抗原也可用于测定抗体在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体②酶标记的抗原或抗体③酶作用的底物根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件可设计出各种不同类型的检测方法（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合形成固相抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合彻底洗涤未结合的酶标抗体此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量根据同样原理将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）这种双位点一步不但简化了操作缩短了反应时间如应用高亲和力的单克隆抗体测定的敏感性和特异性也显著提高单克隆抗体的应用使测定抗原的ELIS在一步法测定中应注意钩状效应（hookeffect）类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象当标本中待测抗原浓度相当高时过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合而不再形成夹心复合物所得结果将低于实际含量钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体故称为间接法操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合形成固相抗原抗体复合物经洗涤后固相载体上只留下特异性抗体其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合在洗涤过程中被洗去（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合从而使该抗体间接地标记上酶洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量例如欲测人对某种疾病的抗体可用酶标羊抗人IgG抗体（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量本法只要更换不同的固相抗原可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体（四）竞争法竞争法可用于测定抗原也可用于测定抗体以测定抗原为例受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比操作步骤如下：（1）将特异抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液使之与固相抗体反应如受检标本中无抗原则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合如受检标本中含有抗原则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会使酶标抗原与固相载体的结合量减少参考管中只加酶标抗原保温后酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量洗涤（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多故颜色最深参考管颜色深度与待测管颜色深度之差代表受检标本抗原的量待测管颜色越淡表示标本中抗原含量越多（五）捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在后者会干扰IgM抗体的测定因此测定IgM抗本多用捕获法先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上在去除IgG后再测定特异性IgM操作步骤如下：（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上形成固相抗人IgM洗涤（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合洗涤（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合洗涤（5）加底物显色：如有颜色显示则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在是为阳性反应（六）应用亲和素和生物素的ELISA亲和素是一种糖蛋白可由蛋清中提取分子量60kD每个分子由4个亚基组成可以和4个生物素分子亲密结合现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）生物素（biotin）又称维生素H分子量244.31存在于蛋黄中用化学方法制成的衍生物生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimideBNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物亲和素与生物素的结合虽不属免疫反应但特异性强亲和力大两者一经结合就极为稳定由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置可以连接更多的生物素化的分子形成一种类似晶格的复合体因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来就可大提高ELISA的敏感度亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式可用于间接包被亦可用于终反应放大可以在固相上先预包被亲和素原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量而且使其结合点充分暴露另外在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代然后连接亲和素－酶结合物以放大反应信号ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色一、ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性又保留酶的活性在测定时受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开再加入酶标记的抗原或抗体也通过反应而结合在固相载体上此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例加入酶反应的底物后底物被酶催化成为有色产物产物的量与标本中受检物质的量直接相关故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析由于酶的催化效率很高间接地放大了免疫反应的结果使测定方法达到很高的敏感度二、ELISA的类型ELISA可用于测定抗原也可用于测定抗体在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体称为"酶联物"、"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件可设计出各种不同类型的检测方法用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体联结形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质（2）加受检标本保温反应标本中的抗原与固相抗体结合形成固相抗原抗体复合物洗涤除去其他未结合物质（3）加酶标抗体保温反应固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合彻底洗涤未结合的酶标抗体此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关（4）加底物显色固相上的酶催化底物成为有色产物通过比色测知标本中抗原的量在临床检验中此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等只要获得针对受检抗原的异性抗体就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法如抗体的来源为抗血清包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物如应用单克隆抗体一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗分别用于包被固相载体和制备酶结合物这种双位点夹心法具有很高的特异性而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应作一步法检测在一步法测定中当标本中受检抗原的含量很高时过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合而不再形成"夹心复合物"类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同如按常法测读所得结果将低于实际的含量这种现象被称为钩状效应（hook effect）因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落钩状效应严重时反应甚至可不显色而出现假阴性结果因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时应注意可测范围的最高值用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇例如HBsAg的a决定簇也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物但在HBsAg的检测中应注意亚型问题HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性这也是用单抗作夹心法应注意的问题双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰RF是一种自身抗体多为IgM型能和多种动物IgG的Fc段结合用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF它可充当抗原成份同时与固相抗体和酶标抗体结合表现出假阳性反应采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂由于去除了Fc段从而可消除RF的干扰双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原因其不能形成两位点夹心（二）双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似用特异性抗原进行包被和制备酶结合物以检测相应的抗体与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体此法中受检标本不需稀释可直接用于测定因此其敏感度相对高于间接法乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法本法关键在于酶标抗原的制备应根据抗原结构的不同寻找合适的标记方法（三）间接法测抗体(我公司分装TORCH及传染病试剂盒大多采用本法)间接法是检测抗体常用的方法其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体故称为间接法（见图2-3）操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体联结形成固相抗原洗涤除去未结合的抗原及杂质（2）加稀释的受检血清保温反应血清中的特异抗体与固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物经洗涤后固相载体上只留下特异性抗体血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去（3）加酶标抗抗体可用酶标抗人Ig以检测总抗体但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合从而间接地标记上酶洗涤后固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关（4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法间接法成功的关键在于抗原的纯度虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果但应尽可能予以纯化以提高试验的特异性特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质例如以E.Coli为工程酶的重组抗原如其中含有E.Coli成份很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质例如来自人血浆或人体组织的抗原如不将其中的Ig去除试验中也发生假阳性反应另外如抗原中含有无关蛋白也会因竟争吸附而影响包被效果间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分IgG的吸附性很强非特异IgG可直接吸附到固相载体上有时也可吸附到包被抗原的表面因此在间接法中抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次以封闭（blocking）固相上的空余间隙另外在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200）以避免过高的阴性本底影响结果的判断（四）竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去或不易得到足够的纯化抗原时可用此法检测特异性抗体其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合标本中抗体量越多结合在固相上的酶标抗体愈少因此阳性反应呈色浅于阴性反应如抗原为高纯度的可直接包被固相如抗原中会有干扰物质直接包被不易成功可采用捕获包被法即先包被与固相抗原相应的抗体然后加入抗原形成固相抗原洗涤除去抗原中的杂质然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应竞争法测抗体有多种模式可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合抗HBc ELISA一般采用此法另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合洗涤后再加入酶标抗体与结合在固相上的抗原反应抗HBe的检测一般采用此法（五）竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点因此不能用双抗体夹心法进行测定可以采用竞争法模式其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合标本中抗原量含量愈多结合在固相上的酶标抗原愈少最后的显色也愈浅小分子激素、药物等ELISA测定多用此法（六）捕获包被法测抗体（经典方法）IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上因此如用抗人IgM作为二抗间接测定IgM抗体必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理以除去IgG的干扰在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法先用抗人IgM抗体包被固相以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）然后加入抗原此抗原仅与特异性IgM相结合继而加酶标记针对抗原的特异性抗体再与底物作用呈色即与标本中的IgM成正相关此法常用于病毒性感染的早期诊断甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式见图2-7.类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体导致假阳性反应因此中和IgG的间接法近来颇受青睐用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功（七）ABS-ELISA法ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语亲和素是一种糖蛋白分子量60000每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成生物素为小分子化合物分子量244.用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物标记方法颇为简便生物素与亲和素的结合具有很强的特异性其亲和力较抗原抗体反应大得多两者一经结合就极为稳定由于一个亲和素可与4个生物素分子结合因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）在LAB中固相生物素先与不标记的亲和素反应然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度在早期亲和素从蛋清中提取这种卵亲和素为碱性糖蛋白与聚苯乙烯载体的吸附性很强用于ELISA中可使本底增高从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点在ELISA应用中有替代前者的趋势由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂增加了操作步骤在临床检验中ABS-ELISA应用不多科研项目中检测微量的成分如细胞因子常采用本法ELISA试剂的临床质量评价点击次数：48 发表于：2008-08-04 13:25 转载请注明来自丁香园来源：丁香园ELISA试剂的评价（evaluation）分两个方面：一是试剂本身的质量评价符合一定要求后才能生产供应；一是在临床应用中效果的评价以肝炎ELISA诊断试剂为例首先必须通过中国药品生物制品检定以得到生产的许可检定内容除包装、标签、说明书等外对试剂的性能如特异性、灵敏度、精密度和线性等均需逐项检定通过对一系列参比品的检测结果符合要求者才为合格ELISA试剂的临床质量评价是用该试剂对临床样本进行检测以观察其实际应用价值部临检中心对乙肝ELISA诊断试剂在这方面进行了工作通过质量评价促进了试剂质量的提高一、诊断试剂临床质量评价要点从临床应用角度考核检验试剂的可靠性是以其能否区分健康与疾病的能力作为依据的目前还很难找到100%可靠的试验任何试验都会出现假阳性或假阴性判断试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作为考核标准临床应用的灵敏度用疾病患者试验阳性的百分率表示特异性以无病者试验阴性的百分率表示进行这种评价首先需要收集有关的病人血清然后用公认的检测该项标志物最可靠的试剂进行测定以确定其为阳性或阴性这一组表明测定物为阳性或阴性的血清组成"血清盘"（panel）被评价的试剂测定此血清所得结果与血清盘标明的结果的关系如下表：血清盘结果合计＋－受检试剂结果＋ a b a+b － c d c+d 合计a+c b+d A+b+c+d 表中a为真阳性b为假阳性c为假阴性d为真阴性被评价试剂的各项性能指标按以下分式计算：灵敏度(%)=a/(a+c)×100%特异性(%)=b/(b+d)×100%符合率(%)=(a+d)/(a+b+c+d) ×100%一般认为灵敏度或特异性>90%为良好符合率是综合灵敏度和特异性的指标二、临床考核血清盘的制备要求1、采用人的原血清；2、血清盘应具有相应的稳定性；3、血清盘中样本不含防腐剂或只含极微量的、不影响检验结果的防腐剂；4、血清盘所包含的阴性样本和阳性样本约各占一半；5、阳性样本中应有一定数量的强阳性和弱阳性样本；6、血清盘中应有一定数量的临界值上、下含量的样品以检验试剂的灵敏度7、血清盘中应包含与该项检验相关的病种样本和已积知具有干扰物质（RF因子）的样本以检验试剂的特异性三、临床考核血清盘的建议以抗-HBc-IgM为例部临检中心收集近百例临床肝炎病人的样本经美国abbott公司抗-HBc-IgM试剂反复检验筛选选出血清70份其中阳性29份阴性41份组成抗-HBc-IgM临床考核血清盘在70份样本中除7份为无病历的质控血清外抗-HBc-IgM阳性的22份样本中含临床诊断急性肝炎16例、慢性活动性肝炎5例、重症肝炎1例；抗-HBc-IgM阴性的40份样本中含临床诊断慢性迁延性肝炎24例、急性肝炎例（均为恢复期采的血样）、慢性活动性肝炎8例（其中5例为恢复血样）因此这套抗血清盘用于商品试剂的临床考核可以将临床上乙肝急性期、慢性活动期病人区分开具有临床诊断意义。

elisa原理和步骤ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）是一种检测生物分子的方法，主要用于检测抗原或抗体的存在。

它是一种非常灵敏、快速、可靠的检测方法，广泛应用于医学、生命科学、生物工程、环境监测等领域中。

下面就为大家详细地介绍一下ELISA的原理和步骤。

1. 原理ELISA的原理是利用酶作用产生的光信号来检测目标分子。

一般来说，ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等几种类型。

其中最常使用的就是间接ELISA。

间接ELISA主要是利用抗体的特异性识别目标抗原，然后用另一种抗体与其结合，标记上酶来检测。

当样品中含有目标抗原时，它将特异性地结合到ELISA板上的抗体上，随后加入酶标记的第二抗体，在洗涤后酶标记的抗体得以固定。

最后，加入底物后，酶作用会产生光信号，信号的强度与目标抗原的浓度成正比。

2. 步骤（1）涂覆ELISA板将检测抗体溶液加入到微孔板中，一般是96孔板，放置过夜。

它的作用是将检测抗体吸附到微孔板上，形成成分固定的ELISA板。

（2）阻断加入一定浓度的蛋白质或其他酶抑制剂，以防止非特异性的蛋白质与孔的表面互相结合，从而阻止抗体结合并引起假阳性的结果。

（3）加入样品加入待测试的样品，通常需要稀释样品以得到正确的浓度范围。

ELISA可以检测抗原或抗体，或者两者之间的竞争。

如果检测的是抗原，则加入样品和待测物，如果检测的是抗体，则加入包含特异抗原的样品。

（4）加入检测抗体加入与检测抗原特异性结合的检测抗体，也称为探针抗体。

这个抗体标记了酶，通常是使用HRP（辣根过氧化物酶）。

（5）加入底物加入底物，就是加入一种可以被该特定酶催化分解的化合物，以产生一个可检测的信号，通常是这种底物是TMB（3,3′,5,5′-四甲基联苯二胺）。

（6）读取结果使用酶标仪读取微孔板的吸收值，可以算出待测样品中目标分子的含量。

通常会测量每个孔的吸光度，并使用标准曲线来计算样品中目标分子的浓度。

ELISA原理及步骤ELISA，即酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay），是一种常见的免疫学实验技术，在生物医学研究和临床诊断中广泛应用。

它基于抗原与抗体的特异性结合，在酶的催化下，通过颜色的变化来检测和定量分析目标分子的存在。

一、ELISA原理1.包被：将抗原或抗体固定在微孔板表面。

2.孵育：加入待测标本，使抗原和抗体充分结合。

3.清洗：去除未结合的物质。

4.检测：加入酶标记的抗体或底物，与已结合的抗原或抗体反应。

5.测定：加入底物后，产生可测量的信号，如颜色变化。

6.分析：对信号进行测量和定量分析。

二、ELISA步骤1.准备试剂和材料：-抗原或抗体：根据需要选择合适的抗原或抗体。

-微孔板：常用的是96孔或384孔微孔板。

-缓冲液：包括洗涤缓冲液、稀释缓冲液等。

-酶标记二抗和底物：根据需要选择适合的酶标记二抗和底物。

2.包被抗原或抗体：-将抗原或抗体稀释至合适的浓度。

-加入微孔板孔中，使其吸附在孔底。

-孵育在4℃或37℃下，一般需要数小时或过夜孵育。

3.添加标本和控制样品：-将待测标本和控制样品逐孔加入微孔板中。

-孵育一段时间，使抗原和抗体发生特异性结合。

4.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。

-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。

5.加入酶标记二抗：-将酶标记的二抗加入每个孔中。

-孵育一段时间，使其与已结合的抗原或抗体结合。

6.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。

-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。

7.加入底物：-加入适合的底物。

-孵育一段时间，使底物与酶发生反应。

8.反应停止：-加入适当的溶液，停止底物酶反应。

9.测定信号：-使用光密度测定仪读取每个孔的吸光度。

-记录吸光度值，用于后续数据分析和定量结果。

三、ELISA的注意事项-实验过程中需严格控制温度和时间，尤其是孵育和洗涤步骤。

-各个试剂需事先准备好，避免其中一步骤时间过长导致信号的变化。

elisa原理及步骤Elisa原理及步骤。

ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度。

它的原理基于酶标记的抗体或抗原与待检测样品中的特定分子结合，然后通过酶介体的作用产生可定量检测的信号。

ELISA方法具有高灵敏度、高特异性和简单操作的特点，因此在生物医学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。

ELISA的原理。

ELISA方法的原理是基于抗体-抗原的特异性结合。

在ELISA实验中，待检测的抗原或抗体首先被吸附在微孔板上，然后加入特异性的酶标记抗体或抗原，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。

随后，通过加入底物使酶产生可定量检测的信号，最终通过光度计或荧光计测定信号的强度，从而确定待检测样品中抗原或抗体的浓度。

ELISA的步骤。

1. 样品处理，将待检测的样品（血清、尿液、细胞上清液等）进行处理，如离心、稀释等，以便得到适合实验的样品。

2. 固定抗原或抗体，将待检测的抗原或抗体溶液加入微孔板中，使其吸附在板上，然后对板进行洗涤，以去除未结合的物质。

3. 加入酶标记抗体或抗原，将特异性的酶标记抗体或抗原加入微孔板中，与固定的抗原或抗体结合，形成复合物。

4. 洗涤，对微孔板进行洗涤，以去除未结合的酶标记抗体或抗原。

5. 加入底物，加入适当的底物，使酶产生可定量检测的信号。

6. 反应停止，在适当的时间后，加入反应停止液停止酶的反应。

7. 测定光密度，使用光度计或荧光计测定产生的信号的强度，从而确定待检测样品中抗原或抗体的浓度。

ELISA方法的应用。

ELISA方法在临床诊断、生物医学研究和药物开发等领域得到了广泛的应用。

在临床诊断中，ELISA方法常用于检测感染病原体的抗体、抗原或相关蛋白质，如HIV、乙肝病毒、丙肝病毒等。

在生物医学研究中，ELISA方法常用于检测细胞因子、生长因子、激素等蛋白质的浓度，以及疾病标志物的检测。

elisa常见实验方法摘要：1.ELISA实验原理简介2.ELISA实验步骤概述3.常见ELISA实验方法分类4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景5.提高ELISA实验效果的方法6.ELISA实验中常见问题及解决策略正文：ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于生物医学领域，用于检测蛋白质、抗原和抗体等生物分子的方法。

ELISA实验通过特异性抗体与待检测物结合，再通过酶标记的二抗检测结合物，从而实现对目标分子的定量分析。

以下是ELISA常见实验方法的详细介绍。

1.ELISA实验原理简介ELISA实验基于抗原抗体反应原理，将抗原或抗体固定在固相载体上，待检测样品中的目标分子与固定在载体上的抗体结合，再加入酶标记的二抗，与结合在载体上的抗原或抗体发生反应。

最后，通过底物显色反应，根据颜色的深浅判断待测物含量。

2.ELISA实验步骤概述ELISA实验一般分为以下四个步骤：（1）抗原或抗体固定：将抗原或抗体吸附在固相载体（如酶标板）上；（2）样品处理：对待测样品进行适当处理，使其与实验体系相适应；（3）加样：将处理后的样品和酶标记的二抗加入酶标板，incubate；（4）底物显色：加入底物，酶标记的二抗与抗原或抗体结合后，底物被酶催化显色；（5）读数：用酶标仪测定显色程度，换算成待测物浓度。

3.常见ELISA实验方法分类根据实验过程中抗原抗体结合的方式，ELISA实验可分为以下几类：（1）双抗原夹心法：待测物为抗原，实验中使用两种针对抗原不同表位的抗体；（2）竞争法：待测物为抗体，与固定抗原竞争结合酶标抗体；（3）间接法：待测物为抗体，通过酶标记的二抗检测；（4）免疫共沉淀法：利用抗原抗体结合后形成的免疫复合物与底物结合。

4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景（1）双抗原夹心法：优点为特异性高、灵敏度高，适用于抗原含量较低的检测；缺点为操作复杂，易出现交叉反应。

（2）竞争法：优点为操作简便，适用于抗体含量较低的检测；缺点为特异性相对较低，易受其他物质干扰。

ELISA的基本原理和方法ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生物医学领域的免疫分析方法，被用于检测体内或体外的抗原或抗体。

其基本原理是利用酶标记技术和免疫反应原理来定量测定样品中特定抗原或抗体的浓度。

1.固相吸附：将特定的抗原或抗体固定于具有高亲和性的固相载体，如微孔板。

在微孔板表面以共价键或非共价键结合，确保其稳定性和固定性。

2.样品加入：待测样品中的抗原或抗体与固相载体上的抗体或抗原进行特异性结合。

3.洗涤：通过洗涤步骤，去除非特异性的结合物，保留特异性结合物。

4.酶标记：加入特异性抗体或抗原与被测物结合，并经过化学或酶反应与酶结合或直接偶联。

常用的酶标记物包括辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），它们能够产生可见的信号。

5.洗涤：再次进行洗涤，以去除非特异性的结合物。

6.底物加入：加入酶底物，使其与酶结合发生化学反应，生成可见的信号。

例如，HRP酶作用于染色底物，产生可见的颜色。

7.反应终止：通过加入酸或碱，停止酶反应，并停止信号产生。

8.读取结果：使用酶标仪或颜色比较法测定样品中特定抗原或抗体的浓度，根据信号的强度来定量分析。

根据不同的检测目的和所用的抗原或抗体，ELISA可以分为以下几种常见的方法：1.间接ELISA：通过固相吸附将抗原固定于微孔板上，再加入待测样品，样品中的抗体与固定抗原结合，再加入酶标记的二抗结合到抗体上，经过洗涤和底物加入后，酶反应发生，生成可见的信号。

2.直接ELISA：将酶标记的抗体直接与待测抗原结合，而无需预先固定。

该方法简单快捷，但灵敏度较低。

3.间接竞争ELISA：通过共同的固相抗原和酶标记二抗与待测样品中的竞争抗原或抗体结合，竞争性质绑定，样品中特异性结合物的浓度与酶标记物结合信号强度呈负相关关系。

4.半定量ELISA：通过标准曲线法，将已知浓度的标准样品与待测样品的酶标特异性蛋白或抗体进行竞争，通过样品和已知浓度标准之间的关系，来确定待测样品中特异性结合物的浓度范围。

elisa的检测原理Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用于生物学和医学领域，用于检测目标物质的方法。

Elisa的检测原理基于抗原与抗体之间的特异性结合，通过化学反应产生可测量的信号。

本文将介绍Elisa的检测原理及其具体步骤。

第一部分：Elisa的背景介绍Elisa是一种非常敏感和特异的实验技术，被广泛应用于疾病诊断、药物筛选、蛋白质定量等领域。

其原理是利用特异性抗原与抗体之间的结合反应，通过酶作用产生颜色或荧光信号，从而实现对目标物质的定量检测。

第二部分：Elisa的原理与步骤1. 血清处理在进行Elisa实验之前，需要从样本中提取血清，并进行预处理。

预处理的目的是去除可能干扰结果的物质，如红细胞、血浆等。

经过预处理后的血清样本即可用于后续的实验步骤。

2. 固相吸附在Elisa实验中，一般会使用96孔板作为固相载体。

首先，将需要检测的抗原溶液加入孔板中，并在孔板内表面上形成一层均匀的抗原薄膜。

通常，每个孔位会添加同样的抗原浓度，以确保实验的可靠性和准确性。

3. 特异性结合在已固定的抗原上，加入待测样本（可能存在的抗体），与孔板中的抗原进行特异性结合。

如果待测样本中存在与抗原相匹配的抗体，则会发生结合反应。

这种特异性结合可以用于检测某种特定抗体的存在。

4. 洗涤步骤为了去除未结合的物质，以及降低非特异性背景信号的干扰，需要进行洗涤步骤。

在洗涤过程中，用缓冲液冲洗反应孔位，去除非特异性结合的物质。

5. 检测物的结合在完成洗涤步骤后，加入与待测抗体特异结合的检测物（如辣根过氧化物酶标记的二级抗体）。

该检测物会与特异性结合的抗体形成复合物，并固定在孔板内。

6. 底物反应与信号检测加入底物反应液，通过酶促反应产生可测量的色素或荧光信号。

底物反应液的选择取决于检测系统的设定，在特定条件下，底物与酶的活性发生反应，产生信号。

7. 信号测量与数据分析使用光度计或荧光分析仪测量底物反应产生的信号强度。

根据标准曲线或其他定量方法，可以计算出待测样本中抗原的浓度或抗体的含量。

ELISA的概念、原理、操作步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorentAay)的简称。

它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。

此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、��9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。

即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05MH9.�短妓嵫伟�被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg ／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

(简称洗涤，下同)。

2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0. 1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ "、“-"号表示。

ELISA原理方法及操作细节一、ELISA的原理1.直接ELISA：将抗原直接附着在固相载体上，通过特异性抗体的结合来检测抗原的存在和浓度。

2.间接ELISA：将已知的抗原附着在固相载体上，再加入待测样品，通过特异性抗体和二抗的结合来检测抗体的存在和浓度。

3.夹心ELISA：分别在固相载体上附着抗原和特异性抗体，再加入待测抗原，通过特异性抗体和二抗的结合来检测抗原的存在和浓度。

4.竞争ELISA：将已知抗原和酶标记的抗原竞争与待测抗原中的特异性抗体结合，通过酶标记抗体的含量来反映待测抗原的浓度。

二、ELISA的方法以下以间接ELISA为例进行详细介绍ELISA的方法步骤：1.固相吸附：将已知抗原溶液加入微孔板孔中，使抗原吸附在孔壁上。

然后用PBS或BSA溶液冲洗孔板孔，以去除未结合的抗原。

2.阻断：加入BSA或牛血清蛋白溶液等阻断剂，封闭孔壁上的非特异性结合位点。

3.添加待测样品：加入待检测的抗体样品，经过适当的孵育后，将孔板洗涤，去除未结合的抗体。

4.加入检测抗体：加入与待测抗体特异性结合的二抗，如抗人IgG的辣根过氧化物酶（HRP）二抗，HRP会与抗体特异性结合，形成复合物。

5.反应缓冲液：加入含有HRP底物的反应缓冲液，允许HRP催化底物，产生荧光或颜色反应。

6.反应停止：加入止反应剂，停止酶反应，停止颜色的产生。

7.读取结果：使用酶标仪或光密度计测量各孔中的荧光或颜色的强度，根据强度值的差异来判断样品中抗原或抗体的存在和浓度。

三、ELISA的操作细节1.实验前准备：准备所需试剂、材料和设备，并确保其干净和无菌。

2.微孔板处理：在操作前检查微孔板的孔是否完整，边沿是否正常。

可事先进行热处理或使用已经处理好的微孔板。

3.孔的布置：根据需要设置对照孔和待测孔，每种样品应设置多个孔位，以保证实验的可靠性。

4.液体处理：液体的加入和去除要注意均匀和充分，特别是在液体去除时需要彻底排空。

5.孔板洗涤：洗涤液的选择要注意是否会影响特异性结合和反应的准确性，同时洗涤液的温度和洗涤次数也需要严格控制。

ELISA实验原理及操作ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测和定量分析特定分子（如蛋白质、抗原、抗体等）的存在和浓度。

ELISA实验基于特异性抗原-抗体相互作用的原理，其中酶被用作信号发生器。

以下将详细介绍ELISA实验的原理和操作步骤。

实验原理：1.吸附：首先，将待检测物质（如抗原、抗体等）稀释并加入到孔板（通常是96孔板）中的孔中。

然后，将孔板在低温条件下孵育，使待检测物质与孔壁结合。

2.结合：在吸附步骤完成后，孔板中存在未结合的部分空白孔。

这些空白孔将被添加特异性的第二抗体或标记物与待测物质的结合进行识别。

当第二抗体结合到待测物质时，会形成一个抗原-抗体-第二抗体（或标记物）复合物。

3.检测：根据所使用的标记物的不同，有两种常用的检测方法：酶标方法和荧光方法。

在酶标方法中，标记物通常是酶，如HRP（辣根过氧化物酶）或AP（碱性磷酸酶）。

标记物可以与底物反应，产生一个可检测的信号。

通过加入特定的底物和染色物质，可以检测到酶的活性，从而确定待测物质的存在和浓度。

操作步骤：1.准备试剂和设备：如溶液、洗涤缓冲液、酶标板、吸液管、微量分注器、孔板读数仪等。

2.样品制备：将待测物样品适当稀释，并添加到孔板中。

正样和阴性对照也需相应加入。

每个样品应有至少两个孔。

3.孔板处理：将孔板置于4°C的冰箱中孵育一段时间，使待测物与孔壁结合。

然后，将标准物质和对照物质加入到孔板中的相应孔中。

4.吸除样品：将孔板倒置，并使用洗涤缓冲液洗涤孔壁上未结合的物质。

5.结合抗体：加入特异性的第二抗体或标记物，使其与待测物结合。

6.吸除未结合的抗体：用洗涤缓冲液洗涤孔壁上未结合的抗体。

7.信号发生：加入底物和染色剂，允许酶与底物反应，生成可检测的信号。

8.读取结果：使用孔板读数仪测量各孔的吸光度，并将其转化为待测物浓度。

需要注意的是，每个实验都应包括阴性对照、阳性对照和标准曲线。

ELISA原理及步骤ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附法）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的分析技术。

它基于免疫学原理，通过检测特定抗原和抗体的结合来定量测定目标物。

1.直接ELISA的原理及步骤：直接ELISA方法适用于已知抗体，且目标物的抗原性较好的情况。

该方法将特异性的抗原通过硫酸盐或其他方法固定于微孔板上，然后用荧光素标记的抗体与其结合，最后通过测量荧光素的荧光强度来进行定量测定。

步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。

2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。

3）加入荧光素标记的抗体，与抗原特异性结合。

4）洗涤净化微孔板以除去未结合的荧光素标记的抗体。

5）加入底物，并进行发光强度测定。

6）测量荧光素的荧光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。

2.间接ELISA的原理及步骤：间接ELISA方法适用于已知抗原，但目标物的抗原性较差的情况。

该方法在抗原固定之后，加入绕行适体素标记的次级抗体，通过该次级抗体与目标物特异性结合，最后通过测量标记抗体的发光强度来进行定量测定。

步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。

2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。

3）加入特异性的初级抗体与目标物结合。

4）洗涤净化微孔板以除去未结合的初级抗体。

5）加入绕行适体素标记的次级抗体，使其与初级抗体结合。

6）洗涤净化微孔板以除去未结合的次级抗体。

7）加入底物，并进行发光强度测定。

8）测量标记抗体的发光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。

3.竞争ELISA的原理及步骤：竞争ELISA方法适用于已知抗体和已知抗体与抗原的结合关系的情况。

该方法将标记抗原与固定抗原共同加入到微孔板中，通过测量标记抗原与抗体的竞争情况来进行定量测定。

步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。

2）将标记抗原共同加入到微孔板中。

elisa的方法及原理Elisa（酶联免疫吸附测定）是一种常用于检测特定蛋白质、抗体或抗原的分析方法。

它具有高度的敏感性和特异性，被广泛应用于医学、生物学和生物技术领域。

本文将介绍Elisa的原理、步骤和应用。

一、Elisa的原理Elisa基于免疫学原理和酶学反应，通过特异性抗原-抗体反应来检测目标物质的存在与否。

Elisa通常包括以下几个关键步骤：1. 固定抗原：将目标抗原固定在盘或膜上，以便后续的抗体结合反应。

2. 试样添加：将待测样品加入固定抗原的孔中，允许样品中的抗原与已固定的抗原发生结合。

3. 抗原结合：加入特异性的抗体，并使其与待测样品中的抗原结合。

4. 洗涤：通过洗涤剂去除未结合的物质，以减少非特异性反应。

5. 酶标记抗体结合：加入酶标记的抗体，它与待测样品中的抗原结合。

6. 信号发生：加入染色底物，使酶标记的抗体产生一个可测量的信号（如颜色变化）。

7. 信号检测：使用光度计或其他测量仪器测量信号的强度，与标准曲线相比较，确定待测样品中目标物质的浓度。

二、Elisa的步骤Elisa的步骤十分关键，需要严格按照以下程序进行：1. 准备工作：准备所需的试剂和设备，保持实验区域的洁净。

2. 抗原包被：将具有特异性的抗原添加到固相载体（如96孔板或膜）上，制备固定抗原。

3. 样品添加：将待测样品和标准品加入孔中，与固定抗原发生结合。

4. 增强体添加：加入特异性的酶标记抗体，允许其与结合的抗原发生结合。

5. 洗涤：通过洗涤液去除未结合的物质，减少背景干扰。

6. 底物加入：加入染色底物，与酶标记的抗体发生酶学反应。

7. 反应终止：加入终止液，停止酶学反应，保持结果稳定。

8. 信号测量：使用光度计测量发色底物的吸光度，与标准曲线或对照样品进行比较。

三、Elisa的应用Elisa具有广泛的应用领域，以下是一些常见的应用示例：1. 医学诊断：Elisa可用于检测疾病标记物、肿瘤标志物和病原体抗体，用于早期诊断和治疗监测。

ELISA的概念原理操作步骤ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附试验）是一种常用于检测抗原或抗体的高度敏感和特异性的实验技术。

ELISA基于抗原和抗体之间的特异性结合反应，借助酶催化对这种结合反应进行增强，并且可以通过分析底物的酶活性来定量检测分析物的含量。

1.抗原固定：将待测抗原固定在试验板上，可以通过直接吸附或间接固定，例如，在试验板上吸附荧光素偶联的抗体作为捕获抗体，再通过另外的抗原与之结合。

2.阻断：用非特异性蛋白质（如牛血清白蛋白）封闭未吸附的潜在结合位点，以防止干扰物和试剂的非特异吸附。

3.抗体结合：加入试验液中的样品和检测抗体一起加入到试验板中，待检测抗原与固相捕获抗体结合形成复合物，再用洗涤液洗去非特异吸附物。

4.二抗结合：加入与待测抗体免疫球蛋白特异性结合的标记（如HRP酶标记的抗人免疫球蛋白）二抗，形成"抗原-一抗-二抗酶标纯化物"复合物。

5.洗涤：将非特异性吸附的试剂彻底洗净。

6.酶底物反应：加入酶底物（如TMB底物）反应，形成可呈色的产物。

7.酶停止反应：加入酶停止液中的酸，停止酶的活性，颜色转变为黄色。

8.光度计测定：用光度计测定所生成的黄色产物的吸光度，与待检测抗原的浓度成正比关系。

1.准备试验板：选择适宜的试验板（通常为96孔或384孔的微孔板），吸附待测抗原于试验板上，封闭非特异吸附位点。

2.建立标准曲线：将一系列已知浓度的标准物质添加到试验板上，用于后续的定量测定。

3.添加样品和检测抗体：将待测样品添加到试验板中，同时加入检测抗体。

确保足够的洗涤步骤以去除非特异吸附物。

4.添加标记二抗：加入标记的二抗，该二抗对待测抗体免疫球蛋白进行特异性结合。

5.洗涤：将试验板洗涤数次，以去除未与特异抗体结合的非特异抗体。

6.酶底物反应：加入酶底物，观察产生的可呈色产物。

7.酶停止反应：加入酶停止液停止酶底物反应。

ELISA原理：利用抗原抗体的特异性反应，结合酶对底物的高效催化作用，来检测靶蛋白的含量。

实验时，需要将抗原或捕获抗体包被于固相载体上，通过检测分子（酶或荧光基团），将化学信号转换为电信号，以OD值或发光值的结果，对靶蛋白进行定量分析。

具体原理：ELISA的基础是抗原或抗体的酶标记，利用结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。

再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。

此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

分类：①直接法（Direct ELISA）：直接法将抗原或抗体固定到酶标板上，用带有酶标记的一级抗体或一级抗原，与之特异性结合，再利用酶催化底物显色，即可测定总靶标蛋白的含量。

②间接法（Indirect ELISA）：间接法常用于检测抗体。

将抗原固定到酶标板上，加入一抗，与抗原特异性结合，再加入带有酶标记的二抗，使二抗与一抗特异性结合，最后加入底物，使底物与酶反应显色，即可测定总靶标蛋白的含量。

③夹心法（Sandwich ELISA）：夹心法分为双抗体夹心法和双抗原夹心法，适用于检测具有多个识别位点的大分子蛋白等。

双抗体夹心法ELISA：此方法常用于检测抗原。

将抗体固定在固相载体上，加入待测抗原，与抗体特异性结合，再加入酶标抗体检测，并利用底物显色，即可测定总靶标蛋白的含量。