药品微生物限度检查方法介绍

8
菌种保存的常用方法
琼脂斜面低温保存法 甘油冷冻管保藏法 半固体琼脂斜面低温保存法 液体石蜡保存法 超低温保存法（菌种） 砂土
9
菌种的复壮
分离纯化：琼脂平板分离、单细胞（菌体或孢子）的 分离 通过宿主复壮 淘汰退化 理化因素诱变
10
菌种的管理
专人管理，加锁保存在冰箱内，保存菌种的冰箱不得 放置食品及易挥发性试剂及有机溶媒等 定期有专人按操作规程进行传代接种 菌种定期检查，发现染菌及变异现象应及时报告，研 究处理。 实验菌种不得任意带出 使用致病菌时应及时通知保管人员，用后必须及时处 理
18
4、含动物组织（包括提取物）的口服给药制 剂 5、有兼用途径的制剂 应符合各给药途径的标准 6、霉变、长螨者 以不合格论 7、原料及辅料 参照相应制剂的微生物限度标准执行
19
供试品的抽样及检验取量
一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量的3倍量 （以备复试）。贵重药品检验量可以酌减（至少要够 各种菌检查用的溶液）。 所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位（中药密丸、 膜剂，需取自4丸、4片以上）。 固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10g。 液体制剂检验量为10ml。 膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为50m2,化学药及 生化药膜剂检查量为10cm2。 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问 的样品，但明显破裂的包装不得作为样品。 凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出 长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格 品，无需再抽样检验。 20
活微生数（个）/m3 ≤5 ≤100 ≤500
个/（∮90mm.0.5h） ≤1 ≤3 ≤10
6
菌种保存、复壮及管理
保存原则 保存方法 复壮 管理
7
菌种的保存原则
挑选特征典型的纯菌菌落 确定保存的合适菌体形态，凡能产生孢子或芽孢的微 生物都用孢子或芽孢保存 选择最适宜的保存方法进行保存 定期对保存的菌种进行检查
接种白色念珠菌的新鲜培养物至改 良马丁培养基中， 23～28 ℃培养 18~24小时，取此培养物1ml加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增 稀释法，稀释至10-5 ~10-7，使细菌 数约为50~100cfu/ml。
14
菌液的制备（3 菌液的制备（3）
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马 丁琼脂斜面培养基上， 23～28 ℃培 养5～7天，加3~5ml0.9％无菌氯化钠 溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 取1 ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml， 采用10倍递增稀释法，稀释至104~10-6，使细菌数约为50~100cfu/ml。
30
供试液的稀释（10倍递增稀释法） 供试液的稀释（10倍递增稀释法）
10g 1ml 1ml 100ml 10ml 10ml 1:10 1:100 1:1000
至少3个稀释级，每递增1个稀释级，必须更换吸管。 管内混合吹打不少于10次，吸液在液面下2.5cm处，放 液在液面上1cm处，延内壁缓缓吹出全部溶液，然后将 吸管放入消毒液缸内。
乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应证明是有效的， 并对微生物无毒性。 水浴加温时，温度不超过45℃，时间不超过30分钟。 供试液从制备到加入培养基，不超过1小时。 供试液的体积：最终体积为100ml。
25
供试液的制备（2 供试液的制备（2）
稀释剂： pH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液 肠溶制剂 pH7.6磷酸盐缓冲液、 pH6.8 pH7.6 pH6.8磷酸盐缓冲液 非水溶性供试品 乳化剂：5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚 山梨酯80的无菌混合物（事先配制好、灭菌消 毒）。 十四烷酸异丙酯萃取或过滤
27
供试液的制备（4 供试液的制备（4）
非水溶液性供试品 软膏剂、乳膏剂、称供试品5g（5ml），加到 含已灭菌溶化并45℃保温的乳化剂的烧杯中，用无菌玻棒搅拌混 匀后，慢慢加入45℃左右的稀释剂85ml，边加边搅拌，使供试品 充分乳化，作供试液（1:20）。 油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯—80 5 –8ml，摇匀，再加 入稀释剂至100ml。
供试品的保存
供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿 冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件 不妥引起致死或繁殖。 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁 开启。包装已开启的样品不得作为供试品。
21
细菌、霉菌、酵母菌计数
22
实验前的准备工作
将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试 管、吸管（1ml、10ml）量筒等移到无菌室内，每次试 验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作 中出入，操作编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。 开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作 不低于30min。 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外灯，进入缓冲间，换 工作鞋。再用0.1%新洁尔灭或其他消毒液洗手或用乙 醇棉球擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙 醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋的开口处周围，待干 后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。
栓剂，称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45℃水浴保 温10min，使溶，加入灭菌聚山梨酯80 5—8ml，振摇使之乳化，再加稀 释剂（稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml），摇匀。
28
供试液的制备
气雾剂，将供试品置冰箱（4--8℃）1h，取出，用碘伏棉球（也 可用乙醇棉球）擦拭试品开启部位周围，然后以无菌钢锥钻孔并 插入容器中，勿移出钢锥，以转动方式使容器抛射剂全部抛出。 以无菌注射器吸出全部溶液，按标示量补加稀释剂至足量（若含 非水溶性成分，加适量无菌聚山梨酯—80液）此液即为供试品原 液。 膜剂 将药膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至100ml， 于45℃±1℃水浴中保温，振摇使溶。 茶剂，取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至100ml，振 摇30s,以灭菌纱布过滤，（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结 果按1：10加稀释剂，浸泡30min）。 以 上供 试品如 吸水 膨胀， 或粘 度过高 ，可 增加稀 释剂 ，制 成 1:20—1:100供试液。
31
注平皿
在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取 各种稀释液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低 稀释级吸液时可用1支吸管），每一稀释级注2-3个平 皿（此时一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸 管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中， 管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。同时作阴 性对照（待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管取 稀释剂各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数 阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用 YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌 数阴性对照。
11
菌种
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104] 生孢梭菌(Clostridium 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64941] 白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F) 98001] 白色念珠菌(Candida 黑曲霉(Aspergillus 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F) 98003] 大肠埃希菌(Escherichia 大肠埃希菌(Escherichia coli)) [CMCC(B) 44102] 枯草芽孢杆菌(Bacillus 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63501]
12ຫໍສະໝຸດ Baidu
菌液的制备（1 菌液的制备（1）
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜 绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤中， 30～35℃培养18~24小时，取此培养液 1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10 倍递增稀释法，稀释至10-5 ~10-7，使细 菌数约为10~100cfu/ml。
13
菌液的制备（2 菌液的制备（2）
23
平板菌落计数法
供试液制备 （10倍递增稀释） 注平皿 倒培养基摇合 （45℃营养琼脂 玫瑰红钠琼脂 YPD琼脂培养基） 倒置培养 （ 30～35℃ 48小时；25～28℃ 72小时） 菌落点数 （30～300个 30～100个） 菌数报告 （10条原则）
24
供试液的制备（1 供试液的制备（1）
15
药品微生物限度检查方法介绍
16
2005年版微生物限度标准的应用
• 微生物限度检查法：检查非规定灭菌制剂及其原料、 辅料受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生 物污染程度的重要指标，也是对生产企业的设备器具、 工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学 评价的综合依据之一。 • 药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料 的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药 品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度检查 均以本标准为依据。 • 检查项目：细菌数、霉菌数、酵母菌数及 控制菌的检 查。
26
供试液的制备（3 供试液的制备（3）
液体供试品 取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至 100ml ，摇匀，作为1:10供试液。 含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。 固体、半固体或粘稠供试品，称取供试品10g，置于匀浆杯或适当 灭菌容器中，加入稀释剂至100ml ，用匀浆仪（3000-5000r/， 2—4min）、振荡器或乳钵研磨等方法混匀。胃溶胶囊加稀释剂后 置 45℃±1℃ 水 浴 振 摇 ， 肠 溶 胶 囊 加 无 菌 磷 酸 盐 缓 冲 液 后 45℃±1℃水浴振摇。
药品的卫生学检查方法介绍
（北京市药品检验所
戴红） 戴红）
1
无菌室的质量管理 药品的微生物限度检查 药品的无菌检查
2
无菌室的要求
位置选择 面积大小 洁净度 采光 紫外杀菌 门 人流物流 地面墙面
3
无菌室的管理
陈设尽量简单，仅放置必需用的仪器设备 无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭擦拭操作台及可能污 染的死角，室内无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。 人员：肥皂洗手， 0.1%新洁尔灭洗手，换无菌服、鞋，进入。 操作必须符合无菌要求，穿好无菌服后，不能反复出入无菌间， 手不能来回出入操作台。 在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去空气 湿气，用紫外灯杀菌半小时。 非无菌室工作人员不得进入，对外来维修人员要进行监督。 缓冲间不得放杂物、培养箱等。 定期对门、窗、墙面等消毒。 定期检查洁净度情况。
29
供试品溶液的制备（5）（含抑菌成分的供 供试品溶液的制备（ ）（含抑菌成分的供 试品）
稀释法：10ml供试液种入较大体积的培养基中，一般不超过1000ml 离心沉淀法：3000rpm，30min，底部2ml稀释至10ml。500rpm,5min，上清 液再离心集菌 薄膜过滤法：0.45um的滤膜，冲洗3次，每次至少100ml 中和法：磺胺类 100ml增菌液中含1%的对氨基苯甲酸1ml 砷、汞类 100ml硫乙醇酸盐培养基 洗必泰类 100ml增菌液中加适量的聚山梨酸80等表面活性剂 沉降法：自然沉降5min，取上层液置100ml增菌液中
4
洁净度的要求
应在环境洁净度10000级局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必 须无菌。 工作台面及环境应定期按《医药工业洁 净室（区）悬浮粒子、浮游 菌和沉降菌的 测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
5
尘埃粒子 洁净级别
尘粒数/m3 ≥0.5um ≥5um 100级 ≤3,500 ≤0 1000级 ≤350,000 ≤20,00 100000级 3,500,000 ≤20,000 GB/T16294-1996 沉降菌 洁净级别 100级 10000级 100000级
17
2005年版微生物限度标准的分类 2005年版微生物限度标准的分类
1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的 制剂 应符合无菌检查法的规定。 2、口服给药制剂 3、局部给药制剂 3.1. 用于手术、烧伤及严重损伤的局部给药制剂无菌 3.2. 眼部给药制剂： 3.3、耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂 3.4、阴道、尿道给药制剂 3.5、直肠给药制剂 3.6、其它局部给药