大鼠视网膜神经细胞的原代培养
摘要
目的:在前人建立的方法上优化SD 大鼠视网膜神经细胞体外培养的技术和方法，为后续研究提供实验基础。
方法:使用胰酶消化法分离新生1 ～ 3d SD 大鼠视网膜神经细胞，以DMEM/F12 为培养基体外培养，免疫组织化学染色的方法进行鉴定。
结果:观察光镜下培养的细胞贴壁生长，部分细胞伸出突起，且有些突起相互连接。免疫细胞化学染色显示，培养的细胞大多数抗神经元特异性烯醇化酶(NSE) 抗体反应阳性。结论:视网膜神经细胞体外培养成功为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。
关键词:细胞培养; 视网膜神经元; 胰蛋白酶消化法; 神经元特异性烯醇化酶
引言
一个世纪前，从青蛙身上剥离的神经管片段仍能在生理液中维持几天的活性，使得越来越多的神经纤维得到的实时观测以来，体外培养技术已经广泛的应用于生物技术领域。【1】在没有了完整动物的复杂性，体外培养的方法可以大大提高对视网膜的基本属性和环境的适应性的了解。在体外系统中，这个界定的实验条件可以很容易设定和维持。这提供了一个稳定的辅助药理学和分子操纵的平衡，同时保持了完整的组织复杂表型特征。在这里我们根据一些成功方法报告探讨一下大鼠视网膜神经细胞的原代培养技术。【2-3】
材料与方法
动物：实验中使用的所有SD大鼠幼崽均是从青岛实验动物中心根据眼科和视觉研究中动物的ARVO声明，同时保留了出生后1-3SD大鼠的相对温度和湿度条件下获得的SD大鼠幼崽
材料：DMEM/F12培养液和胎牛血清购自Gibco公司（美国），兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体，兔抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体，羊抗兔IgG 和HRP-链霉亲和素购自中山Goldbridge生物技术有限公司（北京，中国）。所有其他试剂均为Sigma公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。
方法：
预涂层的聚-D-赖氨酸组织培养皿为了使视网膜神经细胞，紧贴组织培养皿，聚-D-赖氨酸添加到被预先放置盖玻片的24孔板的孔中。10分钟后，去除聚-D-赖氨酸，凝固聚-D-赖氨酸孔用无菌蒸馏水冲洗三次，在37℃培养箱隔夜干燥，然后立即使用该板块。
视网膜剥离 1-3天后处死前被麻醉的SD大鼠被转移到Hank，s平衡盐溶液。在无菌条件的光学显微镜下，用注射器的针头刺穿角膜的边缘来打开SD大鼠的每只眼睛。然后用剪刀和镊子剪开针口，小心取出眼睛前部的眼角膜。移除眼球和大部分晶状体后，剩下的两个松散的联结组织和视网膜色素上皮细胞层，轻轻地剥离开来，用镊子轻轻捏开，从而完全取出视网膜视神经组织。
视网膜的分离和培养在37℃下将视网膜放在0.125%的胰蛋白酶溶液中消化15分钟。消化时间结束后，去除消化液，将组织移入Dulbecco's改良Eagle培养基：含10％胎牛血清及营养成分混合的F-12（DMEM/F12培养液），过400目细胞筛，1500rpm离心5分钟，弃上清，将细胞悬浮在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中研磨。用血球计数板检查细胞密度，并把细胞接种在细胞密度为1.0×106个/cm2的涂有聚-D-赖氨酸（0.1mg/ml）的24孔板中，放在37℃，CO2浓度为5%的加湿培养箱中培养。培养的视网膜细胞也可能生长于盖玻片内的这些小孔之中。在接种细胞后24小时,将5-溴-2'-脱氧尿苷（20μg /ml）加入培养基抑制非神经细胞。
48小时之后更换培养基。以后，每两天更换一次培养基，每天用相差显微镜观察培养的细胞，随着时间的推移，观察比较所培养的细胞的形态的变化。
鉴定培养的视网膜神经细胞在体外培养三天后，一旦盖玻片上的单元格长有细胞，则该培养板作废，每个盖玻片用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗三次直至洗净。培养的细胞在4％多聚甲醛固定20分钟，然后在3％过氧化氢中处理10分钟，以降低内源性过氧化物酶的活性再用PBS洗三次。在室温下培养灭活5%正常山羊血清白蛋白10分钟，从而阻止其非特异性结合。用鼠兔抗NSE单克隆抗体（1：50）和兔抗鼠GFAP的多克隆抗体（1：50）作为主要的抗体4℃保温培养过夜。然后洗净盖玻片，再与生物素二抗（羊抗兔IgG抗体，1：100）处理30分钟，再在室温下与酶标链亲和素处理30分钟。经过多次洗涤，颜色在3，3-二氨基四氢氯（DAB）作为辅助底物5分钟的作用下开始显现出来。阴性对照，抗体被非免疫血清所取代。使用显微镜检测盖玻片，并拍摄图片记录实验结果。
结果
形态学结果刚开始细胞呈球形，均匀的分布在培养板上，4个小时之后，培养的细胞开始贴壁生长。24个小时后，大部分细胞已经贴在培养板壁上，细胞形态从球形到三角形或多边形不断变化，未能贴壁的细胞将会被除去（如图1A所示）。48个小时后，细胞都稳定的贴附在培养板上，并且在培养板上生长，这些都表现在细胞数量和细胞质的明显增加。72个小时后，可以观察到小的神经轴突的生长，其中有一些彼此相互连接在一起（如图1B所示）。在
为期5天的细胞培养中，延伸的神经轴突和细胞数量逐渐较少（如图1C所示）。7天之后，神经细胞死亡的比率开始增加，只有少数细胞存活（如图1D所示）。
免疫细胞化学染色检测结果当细胞培养3天后，大部分存活的细胞均为NSE阳性细胞，大约占91.5%，而GFAP阳性细胞仅占2.4%。NSE阳性细胞有圆形或椭圆形，可以看到一些神经突起，GFAP阳性细胞呈扁平或梭形（如图2所示）。阴性对照组无明显现象。
讨论
在体外条件下视网膜组织在单层膜，分离的细胞，切片，重新聚合或移植培养的状态下均能够被培养。在缺乏与其他类型的细胞相互作用的单个细胞的蛋白表达研究中，单层的视网膜培养是非常有效的。此外，移植培养可保持在体外培养的视网膜细胞结构。在组织三维重建和组织工程学中，视网膜重新聚合培养是十分重要的。【4-5】上述培养体系具有自己的意义和优势，由于这种方法可以获得丰富的游离细胞，因此在进行细胞增值和凋亡检测时此种培养方法非常有效。本文介绍的视网膜神经细胞培养体系的建立可以作为一个视网膜毒理学研究的一个模型系统。
原代培养的关键结果是所培养的细胞必须拥有足够长时间的功能和存活，以保证实验研究的进行。在培养过程中，有一些重要的因素，可以影响的结果，其中视网膜细胞的分离就是最重要的一个因素。酶消化法的常用来分离视网膜神经细胞。最常用的酶是胰蛋白酶，但是胰蛋白酶的浓度和消化时间是影响细胞分离的关键因素，这在几个实验室有不同的实验报告。【6-8】合适的胰蛋白酶浓度和消化时间可以产生数量相对较多且具有长时间活力和功能的神
经细胞，反之，则会导致存活率降低，细胞膜损伤和细胞活性大大降低。在实验中，我们使用0.125%的胰蛋白酶在0.02%的EDTA中反应15分钟。结果表明，该方法效果十分显著。
在视网膜神经细胞培养过程中培养条件和培养基的选择是十分重要的通常选用DMEM/F-12培养基来对神经细胞进行培养。DMEM/F-12不包含蛋白质，脂肪，或生长因子，因此，DMEM/F-12可能需要补充营养元素，通常用10％的胎牛血清（FBS），它的添加可以改善细胞的生长同时提高细胞在培养基中的生存能力。但FBS中也有许多不确定因素，如外源性生长因子和激素，这会导致实验结果的巨大偏差。因此，细胞培养中对无血清培养基的选用应该更加科学和谨慎。此外，在体外细胞培养时，神经胶质细胞可以提供神经细胞的神经生长因子，以维持神经细胞的存活和促进神经轴突生长。但是，胶质细胞的增生，能抑制神经细胞的生长和分化。细胞接种24个小时后，向培养基中加入抑制非神经细胞和视网膜神经胶质细胞的5 - 溴-2'-脱氧尿苷( 20μg /ml)。
在许多不同的层面视网膜功能和疾病的研究会发现，从流行病学和种群遗传学到人类和整个动物实验的研究再到视网膜特定基因的个别碱基的作用，每种方法都有它的优点和缺点。我们认为，采用离体的细胞培养系统进行研究，尤其是在原代神经细胞的培养能够成为一个极具价值的“水平”研究。视网膜神经细胞体外培养成功有助于对视网膜疾病的研究。
参考文献
1 Harrison RG． Obervation on the living developing nervefiber．Anat Rec 1970; 1( 2) : 116-119
2 Leifer D，Dreyer EB，Lipton SA． Immunofluorescent characterization of retinal ganglion cell neuritis cultured on substrates coated with antibodies against Thy-1．Exp Neurol 199l; 113( 3) : 386-390
