第二章 色谱法的基本原理

用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开 始为人们所重视。
Izmailov, Shraiber Taylor, Uray
Martin, Synge Consden等 Macllean
Martin, James Van Deemter等
Golay Porath, Flodin
Moore Giddings
分配色谱 (L－L，G－L)
OH Silica base
SO3+N
NH3+
CO2-
OCON(CH3)2
Electrostatic attraction
离子交换色谱 (L－S)
CO2H
空间排阻色谱 (L－S)
2.2 色谱分离原理
2.2.1 分配系数和分配比
1. 分配系数（K）
K Cs Cm
Cs： 被测组分在固定相中的浓度 Cm： 被测组分在流动相中的浓度
各处相同。
V n RT P
气体状态方程
不同位置处，线流速不同
气相色谱中柱内平均体积流速的确定
c点处的平均体积流速
Fc
Fc很难测，且为柱内平均值，Fr易测，求Fr与Fc的关系即可。
Fc
Vc

nc RTc

n
Fc
RTc
t tPc
Pc
n
F c 为柱内气体的平均摩尔流速
Fr
Vr t
nr RTr tPr
各种氨基酸
硅胶为载体 水为固定相
年代 1906
1931 1938 1938 1941 1944 1949 1952 1956 1957 1958 1959 1964 1965 1975 1981
发明者
发明的色谱方法或重要应用
Tswett
用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。
Kuhn, Lederer
Small Jorgenson等
最先使用薄层色谱法。 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。 提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可 作为流动相（即气相色谱）。
发明了纸色谱。 在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入 实用阶段。
从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。 提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。
二、色谱流出曲线构成： 由基线和色谱峰组成。
基线：指仅有流动相通过而没有待测物，检测器响应信号随 流出时间的变化。
色谱峰：在基线上突起的部分，它是由引入流动相中被测物 引起的。
色谱图或色谱流出曲线
2.3.1 色谱峰
描述色谱峰三种参数
峰高(或峰面积)—— 峰的大小 区域宽度—— 峰的形状
高斯分布曲线
分配系数意义：
K Cs Cm
①K是热力学常数，K值除了与温度、压力有关 外，还与被测物、固定相和流动相的性质有关。 ②K值大→Cs大→tR长→移动速度慢。 ③若两组分的K值相等→两个组分分离开。
2. 分配比（k）
k ms ns csVs K Vs K
mm nm cmVm
Vm β
色谱法的缺点
定性能力较差。
二、色谱法的重要概念
固定相 流动相 色谱柱
三、色谱法的分类
1、按流动相所处的状态分类
气—固色谱
气相色谱 --- 用气体作流动相
气—液色谱
液—固色谱
液相色谱 --- 用液体作流动相 液—液色谱
超临界流体色谱
2、按固定相使用的形状分类
①柱色谱：固定相装在柱管内。 ②纸色谱 ③薄层色谱 (纸色谱和薄层色谱又统称作平板色谱)

tM
1
k


tM
1
K
Vs Vm

表达了保留时间与分配系数或容量因子两个重要 参数的关系。 ① 容量因子越大，溶质的保留时间也越长。 ② 对于混合物，分配系数不等是分离的前提。
例2.1 已知Vs = 2.0 mL，Fc = 50 mL·min-1， tR = 5 min，tM = 1 min。求VM，VR， VR' ，k，K。
决定，与被测组分和固定相无关。
2. 保留时间tR
定义：从进样开始到柱后, 组分出现响应信号极大值 时所需时间。
说明：组分的保留时间就是组分通过色谱柱所需的时 间。即组分在色谱柱内运行的时间。
影响因素： ①流 动 相——性质、在色谱柱中的体积Vm和流速 ②固 定 相——性质、在色谱柱中的体积Vs； ③被测组分——性质
2ΔV
0.125 0.125
0.25 0.25
0.125 0.125
4
检测器
3ΔV 4ΔV
12 0.083 0.045
13 0.063 0.05
检测量
0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 流动相体积
2.3 色谱流出曲线
五种磺胺的色谱图
气相色谱分离多环芳烃色谱图
一、色谱流出曲线或色谱图 以检测器对组分的响应信号为纵坐标，流出时间(或流出体 积)为横坐标作图所得的曲线。 R——f (t, V)
基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 发明毛细管柱气相色谱。
发表凝胶过滤色谱的报告。 发明凝胶渗透色谱。
发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采 用抑制型电导检测的新型离子色谱法。
创立了毛细管电泳法。
2.1.2 色谱法定义和分类
一、色谱法的定义
定义：
通常用将各组分带出色谱柱所需的载气体积 或时间表示。
特点： 在一定的固定相和操作条件下，任何一种物质都 有一个固定的保留值，故组分的保留值可用于该 组分的定性鉴定。
1．死时间tM
说明：①实际上就是流动相通过色谱柱所需要的
时间。或是组分在流动相中所消耗的时间。
②tM由色谱柱中流动相体积Vm与流动相流速
3. 调整保留时间（ tR ）'
定义：扣除死时间后的保留时间。 tR' = tR tM
说明：组分在固定相中停留的时间。
注意： t t ' t
R
R
M
4. 流动相的流速
定义： 单位时间流动相所通过的距离----线流速，u 单位时间通过流动相的体积-----体积流速，F 单位时间通过流动相的量-----质量流速，Fm和摩尔
流速，Fn) F、Fm和Fn常称作流量。
线流速 l/t (m/min)
F
体积流速v/t (ml/min)
质量流速m/t (g/min)
说明： ① 在流路的任何一点， 质量流速或摩尔流速相等。 Fm=Fn
② 对于气相色谱，线流速和体积流速可能各处不同； 对于液相色谱，线流速可能不一样，但体积流速可视为
3、按分离过程的物理化学原理分类
① 吸附色谱 (L－S，G－S) ② 分配色谱 (L－L，G－L) ③ 离子交换色谱 (L－S) ④ 空间排阻色谱 (L－S)
吸附色谱 (L－S，G－S)
水
硅胶
Good transport between sample and sorbent Conditioned sorbent
保留值(时间t、体积v)—— 峰的位置
1．峰高h 2．标准偏差σ，0.607h处，拐点处，峰宽正好为2σ 3．峰面积A A＝1.065hY1/2 4．半峰宽Y1/2 Y1/2=2.354σ 5．峰底宽Y=4σ，拐点作切线与基线相交，相交两点间
距离为峰底宽Y。Y1/2、Y统称为区域宽度
2.3.2 保留值
β Vm Vs
β：相比
k ms ns csVs K Vs K
mm nm cm Vm
Vm β
分配比的意义：
①k随K和β的变化而变化； ②k值越大→ms越多→柱的容量大
k又称作容量因子。 ③ k是表征色谱柱对被测组分保留能力的主要参 数。
2.2.2 色谱法分离原理
流动相 进样 A+B+空气
第二章 色谱法的基本原理
一．教学内容
1. 色谱分离的基本概念和基本原理 2. 色谱分离的理论基础 3. 简单的色谱定性和定量分析的方法
2.1 色谱法概述
2.1.1 色谱法的起源和发展
石油醚 石油醚+植物色素
CaCO3固定相 叶绿素(绿色) 叶黄素(黄色) 胡萝卜素(黄色)
液液分配色谱
水 硅胶
乙醇－氯仿(流动 相)
9. 保留值与分配比的关系
被测物在色谱柱内的平均线流速ūx为 流动相在色谱柱内的平均线流速ū为
被测物出现在流动相中的几率为
L u X tR
u L tM
nm ns nm
ūx 与ū 的关系为
uX
u nm ns nm
L为色谱柱长
色谱柱长是一定的，所以
u X tR utM
u
nm ns nm
定义：利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之 间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别， 当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次 平衡，使各溶质达到相互分离。
特点： 高超的分离能力，是一种物理化学分析方法
具体优点：
（1）分离效率高。 （2）应用范围广。 （3）分析速度快。 （4）样品用量少。 （5）灵敏度高。 （6）分离和测定一次完成。 （7）易于自动化，可在工业流程中使用。
R
RC
R
M
8. 相对保留值 r2,1 （选择性因子 α ）
定义：相对保留值 r2,1是指组分2的调整保留值与组 分1的调整保留值之比
公式：
r2,1

t'
R2
t'
R1

V' R2
V' R1
tR2 tR1
VR2 VR1
α越大→两组分容易分离；α = 1时→两组分不能分开。
说明： α只与柱温和固定相性质有关
流动相
B A+B A 空气
固定相
BA B
检测和记录
色谱分离过程的特点：不同组分在通过色谱柱时移动速度不等。
1
0
0
2
0
0
3
0
0
4
0
0
5 0.031 0.001
6 0.078 0.004
7 0.118 0.008
8 0.138 0.014
9 0.138 0.021
10 0.125 0.03
11 0.105 0.04
解：V V
M
m
V 501 50mL M
V 50 5 250mL R
V 250 50 200mL R
t 51
k R
4
t1
M
由
V kK s
V
m
V
50mL
K k m 4
100
V
2.0mL
S
总结 色谱流出曲线可以解决的问题
1．样品所含最少组分个数 2．可以进行定性分析 3．可以进行定量分析 4．可对色谱柱效能进行评价 5. 色谱过程的热力学问题 6. 色谱过程的动力学问题
次恰好为一个塔板体积ΔV。 5. 在所有塔板上，同一组分的分配系数为常数，即和组
分的量无关。 6. 沿色谱柱方向不存在塔板与塔板间被测物的纵向扩散。
假定：K=1 Vs/Vm=1 k=1 n=5 进样量 m=1mg
板体积数 （ΔV）
0
1
2
3
0.5 0
0.5
1ΔV
0.25 0.25
0.25 0.25
tR
utM
nm
tM nm
nm
1
tR ns nm ns nm k 1
nm nm
tR tM (k 1) k tR tM tR'
tM tM
a

t'
R2
t'
R1
t'
R2

tM t'
R1
tM
k2 k1

K2
Vs Vm
K1
Vs Vm
K2 K1
色谱过程方程：
tR
色谱理论
色谱理论需要解决的问题： 影响分离及柱效的因素与提高柱效
的途径，柱效与分离度的评价指标及其 关系 色谱分离过程的热力学和动力学问题。。
2.4 塔板理论
2.4.1 塔板理论的假设
1. 柱分成n段，n为理论塔板数，每段高为H，H为塔板高 度，柱长为L，则n=L/H
2. 所有组分开始都加在第零号塔板上。 3. 在每块塔板上被测物在两相间平衡是瞬间建立的。 4. 流动相是以脉冲式(塞子式)进入色谱柱进行冲洗的，每
Frn
RTr Pr
Frn 为流量计内r处气体的摩尔流速
n
Fc

Frn
Fc
Tc Tr
Pr Pc
Fr
柱内平均压力 Pc
Pc

2 3





Pi Po
Pi Po
3

2
1
1
Po

1 j
Po
r点处载气的压力Pr Pr = Po－Pw
Fc

j Tc Tr
Po Pw Po
Fr
压力校正项 湿度校正项 温度校正项


Pi
2

1
3 Po
2


Pi Po

3



1


j
Leabharlann BaiduPo Pw Po
Tc Tr
5. 死体积VM
定义：不被固定相保留的组分，通过色谱柱时所需
流动相的体积。
计算：VM = tM F c
6. 保留体积VR
定义：从进样开始到柱后出现待测组分响应信号 极大值时所通过的载气体积。
计算： VR = tR Fc
注意：各种保留时间受流动相流速的影响，各种 保留体积与流动相流速无关。
7. 调整保留体积
定义： 保留体积扣除死体积后的体积
计算公式： V ' t ' F V V