仪器分析色谱法的基本原理

几个基本术语：
⑴ 色谱法：借助在两相间分配系数的差异，而使混合物中各 组分获得分离的技术称为色谱分离技术。 ⑵ 固定相：填充柱内的填料（固体或液体）。 ⑶ 流动相：携带样品流过固定相 (气体、液体和超临界流体)。 ⑷ 色谱柱：装有固定相的柱。 色谱分离过程：当流动相中携带混合物经过固定相时，与固定 相发生作用，由于各组分的结构性质（溶解度、极性、蒸汽压 和吸附能力等）不同，这种相互作用产生强弱的差异。在同一 推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，按先 后不同的次序从固定相中流出。
km s ns C sVs KVs K
m m nm C m V m V m
β：相比
Vm Vs
k 随柱温、柱压、相体积变化，由组分及固定液的热力学性质 决定 2020/4/12
2.2.2 分离原理
进样
A＋B＋空气
流动相
B A+B A
流动相 固定相
例：气相色谱法——载气（即流 动相，是一种不与待测物作用、 用来载送试样的惰性气体，如氮 气等）载着待分离的试样通过色 谱柱中的固定相，使试样在两相 中发生反复多次的分配，最后使 各组分分离，然后分别检测，记 录各自202的0/4/1响2 应信号。
组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的 时间和组分在固定相中滞留的时间；tR′实际上是组分在固定相中滞 留的时间。单位(s)或(cm)。
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死体积 Vm
不能被固定相滞留的（惰性）组分从进样到出现峰 最大值时所消耗的流动相的体积。死体积可由死时间 与流动相体积流速F0（L／min）计算：
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2.1 概 述
2.1.1 色谱法发展史
色谱法是俄国植物学家Tswett（茨维特）于1903年首先 提出的。他把植物色素的石油醚抽提液倒入一根装有固体碳 酸钙颗粒（固定相）的竖直玻璃管（色谱柱）中，并再从管 的上部加入纯的石油醚（流动相），任其自由流下。这时植 物色素的抽提液沿玻璃管流动，在管内形成具有不同颜色的 色带，每个色带代表不同的组分。
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2.1.2 色谱法分类
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1、按两相所处的状态分类
气相色谱 -------- 用气体作流动相 液相色谱 -------- 用液体作流动相 由于固定相可分为固体吸附剂和涂在固体担体上或毛细
管内壁上的液体固定相，故可将色谱法分为下述四类：
气–固色谱
气体
固体
流动相
固定相
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液体
、 Y1/2 、Y：区域宽度
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2、 保留值
死时间tm : 不被固定相吸附或溶解的组分进入色谱
柱时，从进样到柱后出现浓度最大值所需的时间。
对于气相色谱，常把空气(TCD)和甲烷(FID)从进样
到出峰的时间称为tm。如图中O-A’。这种物质不被 固定相吸附或溶解，其流速与流动相的流速接近。
S
V(t,x)
这一理论得到结果： 1．分布有一最大，两边逐渐减小； 2．最大及整个分布曲线向后推移； 3．流出曲线方程 (也称塔板理论方程)，即数学表达式：
C
N (V VR )2
Nm e
2VR2
2πVR
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C：不同流出体积时的组分浓度 m：进样量 VR：保留体积 N：塔板数 V ：流出体积
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该理论模型对气相、液相色谱都适用。 Van Deemter方程的数学简化式为:
式中：
H = A+ B+Cu u
u为流动相的线速度；
A，B，C为常数
A——涡流扩散项系数
B——纵向分子扩散项系数
C——传质阻力项系数（ C ＝ C s＋ C m)。其中C s： 固定相传质阻力项系数； C m：流动相传质阻力项系数。
Neff
5.54(tR )2 Y1/2
16(tR)2 Y
有效塔板高度：
H eff
L N eff
根据tR′= tR- tm，k = tR′/ tm ，tR = tm(1+k)，可得
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Neff
N
k 1+
k
2
⒉ 塔板理论的成功与局限
⑴ 成功
① 导出流出曲线数学表达式(模型)；
② 解释了流出曲线形状、浓度极大点；
测定流动相平均线速度ū 时可用柱长L与死时间tm 的 比值计算。
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L u
tm
L tm u
保留时间 tR
试样从进样开始到柱后出现色谱峰极大值所需要时间。如图中OB。它相应于样品到达检测器所需的时间。
tR = tR′+ tm
调整保留时间tR′
扣除死时间后的组份保留时间，
即
tR′ = tR tm
在气相色谱柱内，理论塔板数一般达103～106。塔板数越多，其 流出曲线越接近于正态分布。根据塔板理论可以导出N 与色 谱峰半宽度或峰底宽度的关系：
N
16
tR Y
2
理论塔板高度H： H L N
色谱峰W 越小，N 越大，H 越小，柱效能越高。因此，N 和H 是描述柱效能的指标。
在实际工作中，计算出来的N 和H 值时,有时并不能充分
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假定：K = 1 Vs/Vm = 1 k = 1 n = 5 进样量w = 1
w=1μg 1ΔV 2ΔV 3ΔV 4ΔV
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①分布有一最大，两 边逐渐减小 ②最大及整个分布曲 线向后推移 ③流出曲线方程 （塔板理论方程）
在此检测得到位移 随时间变化曲线
被测物流出色谱柱时流动相中被测物浓度随体积(或时间)的变 化曲线：
③ 离子交换色谱（L-S）：利用组分离子与离子交换剂的交换能 力不同进行分离。
④ 空间排阻色谱（凝胶色谱法，L-S）：用多孔物质对不同大小 分子的阻碍作用进行分离。固定相是一种分子筛或凝胶，利用各 组分的分子体积大小不同而进行分离的方法。
⑤ 亲和色谱：利用不同组分与固定相的高专属性亲合力进行分离 的技术，常用于蛋白质的分离。
Vm = tm·F0
保留体积 VR 从进样开始到柱后被测组份出现浓度最大值时所通
过的流动相体积。如下：
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VR = tR·F0
调整保留体积VR′
某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积
VR′= tR′·F0 或 VR′ = VR - Vm
相对保留值α2,1 某组份2与组份1的调整保留值之比，是一个无因次量。
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3、按分离过程的物理化学原理分类
① 吸附色谱 （L-S，G-S）：利用吸附剂对不同组分物理吸附性 能的差异进行分离。
② 分配色谱（L-L，G-L）：利用不同组分在两相中分配系数的不 同进行分离。在液-液分配色谱中，根据流动相和固定相相对极性 不同，又分为正相分配色谱和反向分配色谱。
① 根据色谱峰个数，可以判断样品中所含组份的最少个数。 ② 根据色谱峰的保留值（或位置），可以进行定性分析。 ③ 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析。 ④ 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能 的依据。 ⑤ 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是 否合适的依据。
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B
A
B
检测和纪录
2.3 色谱流出曲线
色谱流出曲线（色谱图）即色谱柱流出物通过检测 器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标 为信号强度，横坐标为保留时间。
← 色谱峰
峰高
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保留时间（分）
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1、 有关术语
① 基线：柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录 值，即图中O-t 线。稳定的基线应该是一条水平直线。 ② 峰高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，h ③ 标准偏差 ④ 峰面积 A ⑤ 半峰宽Y1/2 = 2.354 ⑥ 峰底宽Y = 4
③ 提出了评价柱效的参数(N)及其计算公式。
⑵ 局限
速率理论
① 仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素；
② 不能说明影响柱效的原因及谱带扩张的原理；
③ 不能说明流速对柱效的影响，实验测得流速不同时N 和H不同。
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2.5 速率理论
1956年荷兰化学家Van Deemter等在研究气-液色谱时， 讨论扩散传质等与色谱过程物料平衡和质量平衡的关系， 考察溶质通过色谱体系总浓度的变化。他提出了色谱过 程动力学理论—速率理论。随后Giddings吸收了塔板 理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散 和传质过程，认为把色谱过程看作分子无规则运动的随 机过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的 各种因素。
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涡流扩散项A
B A
A =2λdP
λ 填充不规则因子 dP 填充物颗粒的平均直径。
影响A的因素：填充物颗粒大小dP和填充均匀性λ(
取决于填充物颗粒的大小分布和装柱情况）有关, 与载 气性质、线速和组分无关。
减小涡流扩散提高柱效的有效途径：使用适当
的粒度且颗粒均匀的担体，并尽量填充均匀。
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色谱法的分类大致如下：
根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表中：
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2.2 色谱分离原理
2.2.1 分配系数和分配比
分配系数：
K Cs Cm
s： 固定相 m：流动相
分配比k（又称容量因子）
定义：在一定的温度、压力下，组分在气–液两相间达平衡 时， 分配在液相中的重量与分配在气相中的重量之比。即
地反映色谱柱的分离效能，因为用tR计算时，没有扣除死 时间tm，应予扣除。所以用tR′代替tR 计算出来的N 值称为 有2效020/理4/12 论塔板数Neff。
为了准确评价色谱柱效能，宜采用有效塔板数Neff和有效塔板高度 Heff。有效塔板数Neff和有效塔板高度Heff消除了死体积影响， 较真实的反映了色谱柱的好坏。
2.4 塔板理论
在自然科学上，科学理论：
假设 理论模型(数学表达式) 实验验证 修改模型 完善
1. 塔板理论假设
①在每块塔板上气液平衡是瞬间建立的。 ②载气以脉冲式(塞子式)进入色谱柱进行冲洗，每次恰好为一个塔
板体积。 ③所有组分开始都加在第零号塔板上，且不考虑沿色谱柱方向的纵
向扩散。 ④在所有塔板上同一组分的分配系数是常数，和组分的量无关。 ⑤柱分成几段，n为理论塔板数，每段高为H，柱长为L，n=L/H。
液体
液–液色谱
2、按固定相形状分类
①柱色谱：固定相装在柱管内。它又可分为填充柱色谱 和毛细管柱色谱。固定相装在色谱柱（玻璃管或毛细管） 内。 ②纸色谱：用滤纸作固定相或载体，把试样液体滴在滤 纸上，用溶剂将它展开，根据其在纸上有色斑点的位置 与大小，进行鉴定与定量测定。 ③薄层色谱：将固定相研磨成粉末，再涂敷成薄膜。样 品的分离形式类似纸色谱。
第二章 色谱法的基本原理
Principles of Chromatography
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本章基本要求
⒈ 理解混合物中各组分在色谱柱内分离的原因； ⒉ 了解色谱流出曲线和术语； ⒊ 理解柱效率的物理意义及计算方法； ⒋ 理解速率理论方程对实际分离的指导意义； ⒌ 掌握分离度的计算方法及影响分离度的色谱参数。
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分子扩散项B/u
B = 2Dg
固定相填充在柱内后使气体扩散路径变弯曲的因素.
Dg 组分在气相中的扩散系数（cm2/s）。 填充柱γ= 0.5-0.7 毛细管柱 γ= 1.0 分子量大的组分Dg小，Dg反比于载气密度（分子量）
的平方根, 故采用分子量较大的载气可使B项降低。 保留时间长, 分子扩散项对色谱峰变宽的影响显著.
2,1
tR'2 tR1'
V VR R'12'
tR2 tR1
α2,1的大小与两组分的选择性有关。α2,1越大，选择性越好， 越容易分离。α2,1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、 柱长、填充情况及流动相流速无关。因此是色谱法中，特
别是气相色谱法中广泛使用的定性数据。
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从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：
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传质阻力项Cu
C u = Cg u + Cl u ＝(Cg+ Cl )u
Cgu --气相传质阻力项；Cg--气相传质阻力系数; Clu --液相传质阻力项； Cl--液相传质阻力系数
气相传质过程：气相传质阻力项与填充物粒度的平方成正 比，与组分在载气流中的扩散系数成反比，因此采用粒度 小的填充物和分子量小的气体作载气可提高柱效。 液相传质过程：减小液膜厚度，增大组分在液相中的扩散 系数，均可提高柱效。
-------- “色谱”（色层）因而得名
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石油醚 植物色素 CaCO3固定相 叶绿素（绿色） 叶黄素（黄色） 胡萝卜素（橙色）
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1941年，Martin、Syuge 发明了液－液色谱。
1952年，James、 Martin 发明了气相色谱。
20世纪60年代，出现了高 效液相色谱。