基因编辑技术的概念和原理

核酸酶的出现和技术体系的完善，基因组编
辑技术获得了飞速发展，并将靶向基因操作
推向高潮，使得定点基因敲除、敲入变得更
为简单且高效。
基因编辑的优势
与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonic
stem cell，ES)技术为基础的基因打靶技术相
比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特
点，可应用到更多的物种上，效率更高，构
附近发现串联间隔重复序列，随后发现这种间隔重 复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。经过 几十年的研究，在2007年终于证明这种重复序列与 细菌获得性免疫的关系。
3. CRISPR /Cas9 基因组编辑技术
在这个系统中，只凭借一段 RNA 便能识别外来基因
并将其降解的功能蛋白引起了研究者的兴趣。直到 2012 年，Jinek 等第一次在体外系统中CRISPR/Cas9 为一种可编辑的短RNA 介导的DNA核酸内切酶，标 志着 CRISPR /Cas9 基因组编辑技术成功问世。
基因编辑的研究背景
目前，获得突变体的常见方法是利用T- DNA 或转座子构建大规模的随机插入突变体库， 但是构建覆盖全基因组的饱和突变体库需要 的工作量大且耗费的时间长。而通过定点突 变的方法使目的基因完全失活，是一种最直 接有效的研究特定基因功能的方法。
基因编辑的研究背景
近年来，随着高特异性及更具操作性的人工
了对 ES 细胞的限制，可以应用于更多的物种，
且定向修饰更加精确，效率更高，所需时间更短,
得到的突变可以通过种系遗传.其中，CRISPR 系
统可以同时进行多靶点的切割，易于得到纯合子
突变体。
基因编辑技术的Leabharlann Baidu望
基因组编辑技术对应的友好位点的选择，多基因
连接策略，表达调控策略等配套的技术体系正在 形成，为今后大规模，多基因的动物改良奠定了 基础。更多基因组编辑畜禽的出现会给畜牧业经 济，人类营养水平和生活质量带来革命性地影响。
基因编辑技术的概念和原理
什么是基因编辑技术？
基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项 新技术。利用该技术，可以精确地定位到基 因组的某一位点上， 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。此过程既模 拟了基因的自然突变， 又修改并编辑了原有
的基因组， 真正达成了“编辑基因” 。
基因编辑的研究背景
ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种
及基因位点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷制约了该技术的推广:(1)以现有 的策略设计高亲和性的 ZFN， 需要投入大量的 工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有
毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但仍
然存在不同程度的脱靶效应。
4. 改造和培育新品种
传统的改造动植物品种的转基因技术是将外
源 DNA 片段插入受体的基因组中，改造基因
功能，使其表达优良的性状，获得人类需要
的品种。基因编辑技术则可以进行定点修饰，
达到高效定向。

Shukla 等对玉米进行肌醇磷酸激酶 1(inositol phosphate kinase 1，IPK1)基因的修饰，使其对 除草剂的耐性增强，在发育的种子中肌醇磷酸
TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 FokⅠ融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶标 位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点. 然后 FokⅠ形成二 聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成双链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同的TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一般为12~20 bp. 实验结果表明, TALENs在靶向DNA时, 第一个碱基为 T 时其 结合效果更佳。
准控制， 可能产生很大的毒副作用。基因编
辑新技术可以精确定位， 在靶位点进行修正
或进行基因切除， 达到基因治疗的目的。
2. 基因治疗
Bacman 等人利用 TALEN 技术清除了来自于
病人线粒体内的有病 DNA。这是 TALEN 首
次应用于线粒体基因的编辑，这项研究有望
用于治疗母系遗传的线粒体病。
2. 基因治疗
Li 等人利用 ZFN 技术能在染色体上精确定位
的优势， 通过 “剪切” 和 “粘贴” 基因，
在实验小鼠体内实现了血友病治疗， 避免了
传统基因疗法带来的插入诱变风险， 首次取
得了基因组编辑在基因疗法上的突破。
3. 构建模式动物
根据人类疾病所构建的动物模型，对研究这
些疾病的发生及其治疗有着重要意义。基因
在一个同源供体存在的情况下，可以进行原基因
的替换。
基因编辑原理
基因编辑技术的种类
目前主要有 3 种基因编辑技术， 分别为： 人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)技术； 转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases，TALEN)技术； RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术 (CRISPR- Cas RGNs)。
1. 基因功能研究
即使对于技术比较成熟的实验室， 利用传统
技术敲除大鼠或小鼠身上的某个基因一般也
需要 1 年以上。基因编辑新技术则不然， 敲
除基因高效快速， 是研究基因功能的有力工
具。
1. 基因功能研究
ZFN 技术已在大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、 拟南芥、玉米、烟草 等模式生物或经济物种 的细胞或胚胎中以及包括诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cells，iPSC)在内的人 体外培养细胞系中成功地实现了内源基因的 定点突变，其中在果蝇、 斑马鱼、大鼠等物 种中还获得了可以稳定遗传的突变体。
价格的问题， 其脱靶效应限制了其在基因治
疗等应用上的发展。
基因编辑技术的展望
随着越来越多物种基因组测序的完成，基因功能
的研究成为后基因时代的重点。基因编辑技术既
可以用正常基因替代突变基因进行性状改良和基
因治疗，也可以用突变基因代替正常基因进行基
因功能的研究。
基因编辑技术的展望
与传统的基因打靶技术相比，基因编辑技术摆脱
可以预见，以基因组编辑技术为核心的现代生物
技术产业将进入黄金时期。
基因编辑技术的展望
总之，基因编辑技术的研发还处于起步阶段，但
其已表现出的相对于基因打靶技术的优势已十分
明显。在未来的发展中，基因编辑技术必将成为
生命科学和生物医学等领域研究与应用的重要工
具。
谢谢大家！
复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生
碱基随机的插入或丢失，造成移码突变使基因失
活,实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基
因序列存在，NHEJ 机制会将其连入双链断裂
DSB 位点，从而实现定点的基因敲入。
基因编辑原理
同源重组修复（HR） 是一种相对高保真度的修
复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情 况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过 程完整的整合到靶位点，不会出现随机的碱基插 入或丢失。如果在一个基因两侧同时产生DSB，
1. ZFN 基因组编辑技术
ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是
基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。
1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的
DNA 结合区域发现了Cys2- His2锌指模块，到1996年，
Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2005
CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转 录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形成 复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的 长度不同, PAM 序列也可能不同。
建时间更短，成本更低。
基因编辑原理
现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即
借助特异性 DNA 双链断裂( DNA double-strand
breaks DSBs) 激活细胞天然的修复机制，包括
非同源末端连接( NHEJ)和同源重组修复(HDR)
两条途径。
基因编辑原理
非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度的修
盐表达谱也发生了与预期一样的改变。

Townsend等以烟草中的丙酮醇合酶(acetolactate
synthase)基因 SuR (SuRA和SuRB)位点为靶标，
育成了对咪唑啉酮(imidazolinone)除草剂和对磺
脲(sulphonylurea)除草剂都有抵抗力的新品种。
基因编辑的不足
基因编辑是一项新技术， 还存在构建复杂和
传统的动物育种方法受到种源的限制，其程
需要耗费大量的人力、物力和财力，经历漫 长的培育过程。而且不同种间的杂交很困难， 育种成果很难取得突破性进展。
基因编辑的研究背景
现代动物分子育种中，分子标记技术能够定位与经 济性状相关的分子标记，锁定基因与性状的对应关 系，从而快捷可靠地对动物后代进行筛选。但是， 利用分子标记技术辅助筛选，改良的程度依然受限 于品种自身已有的基因。 所以，利用基因工程技术进行品种改良，可以突破 种源的限制及种间杂交的瓶颈，获取新品种，因此 分子育种更为本质和直接。
年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识 别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑 中的应用。
ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成 的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断 裂(DSB)。于是， 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源 末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标 位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突 变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目 的。
1. 基因功能研究
2009 年， 威斯康辛医学院、 Sangamo
Biosciences、 Sigma- Aldrich 等多家机构使用
ZFN 技术，成功培育出首只靶基因敲除的大
鼠，而且带有该突变的大鼠所生育的后代同
样带有该基因突变。
2. 基因治疗
传统的基因治疗是将正常的基因片段引入细
胞中替代有缺陷的基因， 但这种方法难以精
三种不同技术的比较
续表
基因编辑新技术的用途

基因功能研究
基因治疗


构建模式动物
改造和培育新品种
1. 基因功能研究
基因敲除是在活体动物上验证基因功能必不
可少的逻辑环节， 但是传统的基因敲除方法
需要通过复杂的打靶载体构建、 ES 细胞筛选、
嵌合体动物模型选育等一系列步骤， 成功率
受到多方面因素的限制。
目前， TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳
动物和植物的位点特异性基因打靶， 与锌指
核酸酶系统相比有较大的应用优势， 但仍然
有些问题需要解决，例如:脱靶效应、TALEN
与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近
序列有关等。
3. CRISPR /Cas9 基因组编辑技术
1987年，Ishino 等在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因
打靶技术是在 ES 和同源重组技术的基础上发
展起来的，模型构建耗时长、成本高，且模
式动物的选择受到 ES 细胞的限制。
3. 构建模式动物
基因编辑新技术不受 ES 细胞的限制，效率高， 速度快，且定点编辑更加精确，可在多种细 胞及生物体的特定位点进行切割和修饰。构 建转基因小鼠第一人 Jaenisch 与其同事最近 利用 CRISPR- Cas 系统又构建了携带特异性 突变的小鼠模型。
2. TALEN 基因组编辑技术
2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)
中发现一种转录激活子样效应因子，它的蛋白核酸结
合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的
对应关系。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被
用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设计性更强，
不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜力。