Tricine SDS-PAGE实用方案
Tricine-SDS-PAGE是用于分离分子量在1-10kD的肽类用的。
一、试剂配配制：
1．Low Bis acrylamide（49.5% T, 3% C）
Acylamide 48.0g
Bis 1.5g
Water make up to 100ml
2. High Bis acrylamide (49.5% T, 6% C)
Acrylamide 46.5g
Bis 3.0g
Water make up to100ml
3. Gel Buffer (3M Tris/cl, PH8.45, 0.3% SDS)
SDS 0.3g
Tris 36.4g
Water make up to 100ml
PH to 8.45 with HCL
注: 3M Tris 配制时不容易溶解,因此配制时我配制了2M Tris,配方如下:
Tris 36.4g
SDS 0.3g
Water make up to 150ml
4. Anode (Lower) buffer 阳极缓冲液(0.2M Tris/cl, PH8.9)
Tris 12.11g
Water make up to 500ml
PH to 8.9 with HCL
5. Cathode (Upper) buffer 阴极缓冲液(0.1M Tris/cl, 0.1M Tricine, 0.1% SDS, PH 8.25) Tris
6.06g
Tricine 8.96g
SDS 0.5g
Water make up to 500ml
注:不用调PH值
6. 4×Tricine SDS Sample buffer 4×上样缓冲液
(Final concentration: 0.05M Tris/cl, 4% SDS, 12% glycerol, 200mM DTT, 0.01% Commasie G 250)
8×Tris.cl/SDS PH 6.8 2ml
Glycerol 4.8ml
SDS 1.6g
Commasie Blue G 250 4mg
Water make up to 10ml
注:8×Tris.cl/SDS PH 6.8配方
Tris 6.05g
SDS 0.4g
Water make up to 100ml
PH to 6.8 with HCL
二、胶的配制
1. 16.5% T 6% C separating gel 30ml
49.5% T 6% C 10ml
Gel buffer 15ml
Glycerol 3.2ml
Water 1.8ml
2. 10% T 3% C spacer gel 30ml
49.5% T 3% C 6.1ml
Gel buffer 15ml
Water 8.9ml
3. 4% T 3% C stacking gel 12.5ml
49.5% T 3% C 1ml
Gel buffer 4.65ml
Water 6.85ml
注: 用Bio-Rad系统, 0.75mm的胶,separating gel 配3ml, 加2.5ml; Spacer gel 配1ml,加0.7ml; Stacking gel 配1.25ml. 灌胶前临时加10%AP（过硫酸铵）和TEMED.
胶配制的通用配方:
三、电泳参数及染色脱色
1. 用Bio-Rad mini 电泳装置进行电泳. 30V 电泳1hr, 100V至电泳结束
2. 固定, 染色及脱色: 小分子量肽类在SDS-PAGE胶中容易扩散,因此电泳结束后, 有时需要固定20min (固定液: 0.5% 戊二醛, 30% 乙醇), 再进行染色20-30min (染色液: 50% 甲醇, 10% 乙醇, 0.2% G-250), 在脱色液(45% 甲醇, 10% 冰醋酸)脱色20-30min; 脱色完毕,把胶放在水中或10%甘油中.
四、电泳示例照片
小分子该选择用tricine-SDS-PAGE.
protocol上写着
the common role of glycerol in SDS gels is to increase the density of
solutions and to
facilitate gel casting; it has no obious effect on protein separation
I tried 25% Tricine gel for 3KD peptide, looks good. Good Luck!
哦，我自己经常做2x多的分子，用的是15%的gel，效果很好的。1xKD的用16%
的PAGE就应该可以了。
你可以试一试Tricine-SDS-PAGE，16%的分离胶，6%的浓缩胶。
分离胶单体母液：46.5g丙烯酰胺+3g双叉丙烯酰胺，双蒸水溶解定容到100ml
凝胶浓度49.5%，交联度6%
浓缩胶单体母液：48g丙烯酰胺+1.5g双叉丙烯酰胺，双蒸水溶解定容到100ml
凝胶浓度49.5%，交联度3%
配方：
分离胶母液3.3ml+凝胶缓冲液3.3ml+30%甘油2.4ml+双蒸水
1.0ml+10%AP45μl+TEMED4.5μl
浓缩胶母液0.3ml+凝胶缓冲液0.93ml+双蒸水
1.27ml+10%AP25μl+TEMED
2.5μl
分离范围 1～100KD，最佳分离范围 2～70KD
初始电压30，等样品进入分离胶电压升至80，最终电压可升至120
