现代动物生物化学1

4、发夹结构 伸展的多肽链弯曲、彼此靠近并呈反向平行 的发夹状结构。 5、Ω环 由6-16个氨基酸残基卷曲形成的Ω型结构。 6、无规则卷曲 主链形成没有规则的卷曲。 7、三股螺旋 由三条左手螺旋的多肽链相互缠绕形成右手 三股螺旋。
（二）侧链构象
1．疏水区 多肽链中具有非极性侧链的氨基酸，其侧 链有疏水趋势，当许多这类非极性侧链聚集 在蛋白质分子内部时，形成疏水区。 许多球蛋白分子中都存在这种疏水区，与 蛋白质的功能有关，如与配基的结合。 2．亲水区 氨基酸的极性侧链趋向于分布在球蛋白分 子的表面，形成一个亲水区，有助于稳定球 蛋白的构象并增加蛋白质的水溶性。与蛋白 质的功能有关，如酶的活性中心。
（三）二级结构
指多肽链主链骨架全部或部分按一定规 律排列形成的空间结构，不涉及侧链构象， 如α-螺旋、β-折叠、β-转角等。 二级结构的类型主要是α-螺旋，其次是β折叠，在不同的蛋白质中这两种结构所占的 比例不同，多数蛋白质具有α-螺旋、β-折叠 的混合结构。
（四）超二级结构和结构域
1．超二级结构
3．肌红蛋白 由一个血红素辅基和一条153个氨基酸残基的多 肽链组成。不同动物肌红蛋白的氨基酸组成和排列 顺序相似，但不同。 4．血红蛋白 由珠蛋白和亚铁血红素组成。不同动物血红蛋 白α-链和β-链结构不同，但有些有高度的相似性， 如人与抹香鲸。 5．α-乳清蛋白和溶菌酶 α-乳清蛋白由123个氨基酸组成，溶菌酶由129 个氨基酸组成，两者多肽链的数目、氨基酸数目、 链内二硫键的位置和数目相似，为同源蛋白质，但 两者的功能不同。
现代动物生物化学
硕士研究生课程
第一讲 蛋白质化学
一、蛋白质的一级结构
（一）蛋白质的构件分子
20种氨基酸都属于α -氨基酸，按侧链 的极性和有无电荷分为非极性侧链氨基酸、 不带电荷的极性侧链氨基酸、带电荷的极 性侧链氨基酸。含特异遗传密码，也称编 码氨基酸。 非编码氨基酸是在蛋白质合成后或合 成过程中由相应的氨基酸残基经修饰而成 的。
（二）同种蛋白质一级结构差异与分子病
同种生物来源的一种蛋白质，有时存在两 种或两种以上形式，它们的氨基酸序列差异 很细微，通常只有一二个氨基酸残基的差别。 这种细微的差别在某些情况下可引起功能的 明显变化，有时甚至引发疾病，如分子病。 分子病是由构成生物体基本物质分子一级 结构发生变异而引起的疾病，这种变异来源 于基因的突变。
（2）β-折叠域：由反平行的β-折叠构成。常见 的是由回型拓扑结构形成的圆筒构象。
（3）α+β域：由α-螺旋和β-折叠不规则堆积形 成的。
（4）α/β域：α-螺旋和β-折叠和交替出现。
（5）无αβ域：结构域中不含α-螺旋和β-折 叠。 基序：许多蛋白质空间结构中存在着 某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局 部区域，称基序。 基序是结构域的组成成分，基序的类 型很多，许多基序与功能有密切关系， 如许多转录因子（蛋白质）的DNA结合 域等。
测定末端氨基酸可确定蛋白质分子中多肽 链的数目。 1）N-末端的测定 常用2、4-二硝基氟苯（DNFB）法、二甲 基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）法、异硫氰酸 苯酯（PTH）法等。 2）C-末端的测定 常用的方法有：肼解法、羧肽酶法、还原 氨基醇法等。
5、肽链的专一性裂解与肽段的分离纯化
1）肽链的专一性裂解 化学裂解法：专一性化学试剂：溴化氰 裂解法；酸水解；碱水解 酶水解法：胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶， 胃蛋白酶等，每一种酶都有一个专一的切点。 2）肽段的分离纯化 可用层析和电泳的方法分离提纯。
3、链的拆离与纯化
由几条肽链组成的蛋白质，须将不同的 蛋白质肽链拆开，并分离纯化。 1）二硫键的拆开 氧化法：过甲酸 还原法：巯基乙醇、巯基乙酸等 2）共价键的拆开 改变pH值：蛋白质解离的临界pH值为 3-4、9-10。 强变性剂：尿素和盐酸胍与巯基乙醇共用。 3）肽链的分离纯化
4、末端氨基酸的测定
基因突变的类型：
（1） 错义突变：由于碱基突变使某一氨基酸的密 码子变成另一氨基酸的密码子。 （2）无义突变：基因中某一氨基酸密码子变为终止 密码子，使多肽链合成提前终止。 （3）移码突变：基因中碱基缺失或插入，造成这一 位置以后一系列或部分编码发生移位错误。 血红蛋白基因突变可导致血红蛋白一级结构改 变而产生异常血红蛋白，引起血红蛋白病。如镰刀 状贫血病，β -链N-末端第6位谷氨酸被缬氨酸取代， 使红细胞的形状变成镰刀型而引起溶血。
三、蛋白质分子构象
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
蛋白质分子构象又称高级结构或空间 结构指蛋白质分子中所有原子在三维空间 的分布。
为研究方便将蛋白的结构划分为不同 的层次，分为一级结构和空间结构，空间 结构又分为二级结构、超二级结构、结构 域、三级结构和四级结构。
（一）主链构象
1、α-螺旋
（1）多肽链以α-碳原子为转折点，以肽链平面为 单位，通过两侧结合键的旋转，形成稳定的右手螺 旋； （ 2 ） 每 圈 螺 旋 有 3.6 个 氨 基 酸 残 基 ， 螺 距 为 0.54nm，每个氨基酸残基围绕螺旋中心轴旋转100o ， 上升0.15nm； （3）相邻两个螺旋之间形成链内氢键，其方向与螺 旋轴平行，氢键由第1个氨基酸残基N原子上的H与 其后第4个氨基酸残基羰基的O原子之间形成; （4）各氨基酸残基测链R基团均伸向螺旋外侧； （5）α-螺旋有左手和右手两种，天然蛋白质绝大多 数为右手螺旋。
（三）蛋白质一级结构的测定
蛋白质一级结构的测定是蛋白质高 级结构和酶活性部位研究的前提。 一级结构测定的基本战略是用两套 断链方法分别将纯化的蛋白质肽链裂解 成肽段，再将各个肽段分离纯化，并测 定每个肽段的顺序，然后比较两套肽段 氨基酸顺序以排定蛋白质一级结构。
1、一级结构测定前的准备
1）蛋白质的纯化 纯度必须达到98%以上。 常用的纯化方法有SDS-PAGE，高效液相层析（HPLC）。 纯度的鉴定常用电泳和层析法 2）蛋白质分子量的测定 常用凝胶过滤、SDS-PAGE、超速离心、毛细管电泳、质 谱等。 3）蛋白质多肽链数目和大小的测定 用还原性SDS-PAGE分析，若分子量变小，则说明此蛋白 质由2条以上多肽链组成，然后将每条多肽链分离出来，分别 测定其一级结构。 4）封闭自由巯基 游离的巯基必须封闭，否则在纯化肽段时易氧化为多种产 物。常用碘代乙酸烷化法。 5）去除N末端封闭的基团 N-末端有时会被封闭，除去N-末端封闭基团。
6、肽段氨基酸排列顺序的测定
常用化学法：Edman降解法；蛋白质序列 测定仪可自动检测氨基酸的性质、含量和氨 基酸序列。
7、蛋白质一级结构的建立
氨基酸排列顺序测定出来以后，将小肽段重新构 成大肽段或蛋白质的一级结构。 1）肽段重叠：将断裂的许多肽段的氨基酸按顺序排 列，最后用重叠的方法确定整个多肽或蛋白质的氨 基酸排列顺序。 原则：将一段一段小肽按一定顺序排列，将各个样 品中相同的氨基酸残基位置对准重叠排列。 2）二硫键位置的确定：将完整的蛋白质分子不经任 何处理，直接用酶或酸水解，用凝胶过滤或离子交 换层析等方法及二硫键鉴定的显色反应，分离检出 其中含有二硫键的肽段，将肽的二硫键拆开，分别 测定两个肽段的顺序，将两个肽的结构与已测定的 蛋白质一级结构进行比较，找出相应的二硫键位置。
αα
βx β
βαβαβ
β-迂回
回形拓扑结构
2．结构域 在蛋白质结构中，一条多肽链上常存在 一些紧密的、相对独立的区域，称结构域。 结构域是蛋白质结构的功能单位和折叠 单位，是在二级结构和超二级结构基础上形 成的特定区域，参与蛋白质结构的装配，并 与蛋白质的许多功能有密切关系。
蛋白中结构域的数目不等，一种蛋白质 分子中的几个结构域，有的十分相似，有的 完全不同。
硫氰酸酶分子中两个相似的结构域
丙酮酸激酶分子中三个不同的结构域
蛋白质中结构域之间的连接不尽相同，彼 此独立的球状结构域之间可借柔性肽链松散连 接，有些结构域之间接触紧密而又广泛，每个 结构域所具有的表面就是肽链构象外表面的一 部分。
a:TATA盒结合蛋白
b:弹性蛋白酶
结构域的类型
（1）α-螺旋域：主要是α-螺旋，由4个接近等 长的α-螺旋依次与其邻近的螺旋相连形成的 近四方体结构。
蛋白中存在由若干相邻的二级结构单元按一定规律组合 在一起，形成在空间上可彼此区别的结构单位，称超二级结 构。主要涉及α-螺旋和β-折叠在空间的组合、排布。 （1）αα：由两股或三股右手α-螺旋缠绕形成的一种紧密的左手 超螺旋。 （2）β×β：由两段平行的β-折叠链借助一段连接链组成，连接 链可以是无规则卷曲或α-螺旋。最常见的组合包含3段平行β折叠和2段α-螺旋。 （3）βββ：由反向平行的β-折叠组成的超二级结构，主要包括 β-迂回和回型拓扑结构。β-迂回中的β-折叠链通过紧凑的β转角连接，回型拓扑结构中的β-折叠是通过一般的肽链越过 反平行β-折叠形成的圆筒结构相连。
1．胰岛素 不同种属哺乳动物胰岛素的功能相同，但其一级 结构不同。胰岛素由A、B两条链组成，不同种属动 物A链第8、9、10三个氨基酸残基和B链C-末端第30 个氨基酸残基有差别，这4个氨基酸残基对胰岛素的 生物活性不起决定性作用。胰岛素结构中有20个氨基 酸保持不变，是胰岛素生物活性所必需的。 2．细胞色素C 带有一个血红素辅基的一条多肽链。不同动物 细胞色素C氨基酸除了不变的残基外，还有相当一部 分是不同的，不同动物间差异有所不同，有些差异很 小，有些差异很大。 在细胞色素C不变的氨基酸残基中，有些位置的 残基对所有生物都是不变的，这些残基称保守残基。
2、氨基酸组成的测定 1）蛋白质的水解 将蛋白质水解成游离的氨基酸，水解的方法 有酸水解、碱水解和酶水解。常用的是酶水解。 酸水解色氨酸全部破坏，应添加巯基乙醇作保 护剂。 2）氨基酸的组成 经典的氨基酸组成分析法是茚三酮法。用自 动氨基酸分析仪经离子交换层析相继分离，各 种氨基酸与茚三酮反应形成紫色化合物，然后 在570nm及440nm波长测定光吸收，计算出氨 基酸的含量。
（二）肽键与肽链
蛋白质是由构件分子氨基酸通过肽键连接而 成的多聚生物大分子多肽。 肽键 —CO—NH— （酰胺键） 水解肽键的酶有内肽酶和外肽酶两类，内肽 酶对氨基酸的种类有选择性；而外肽酶对氨基 酸的种类无选择性。 10个以下的肽称寡肽，10个以上的肽称多肽。 一条多肽链有一个C末端和N末端。 二硫键是蛋白质结构中常见的一种共价键。 多肽与蛋白质的区分通常以50-100个氨基酸 为界，但并非绝对。
（三）活性肽一级结构与功能
活性肽是一类分子量小于6000，构象松 散，具有多种生物功能的小肽，其主要功 能是传递信息，调节代谢和协调器官功能。 包括多肽激素、组织激肽、神经肽等， 其一级结构的改变可使活性升高、降低或 消失。 根据这一特点，可对其结构进行改造 或人工合成。
活性肽含量甚微，代谢快，容易降解， 活性检测很困难。随着高灵敏度多肽分离 纯化、定量技术的应用，检测方法迅速发 展，基因工程技术已成为测定活性肽结构 的重要手段，新活性肽的发现和结构与功 能关系的研究，为从基因水平阐明其调节 机能，以及进行基因改造以提高其活性或 功能，提供了新的途径。
A-1 A-2 B-1 B-2 A-3 B-3 A-4
AF AFGR GRLY LYKW KW WHS HS AFGRLYKWHS
二、蛋白质一级结构与功能的关系
（一）同源蛋白质一级结构差异与分子进化 同源蛋白质： 在不同生物种属中执行同一功能的蛋白质。 不同生物体的同源蛋白质一级结构在氨基 酸组成和顺序上不同，存在种属差异。同源蛋 白质一级结构的差异可反映种属间的亲缘关系， 但不影响其生物学功能。
2、β-折叠 存在与大量丝蛋白和β-角蛋白中。 由两条或多条伸展的肽链借助链间氢键 形成的折叠片层结构，氢键与链垂直，α-碳 原子处于折叠角上，侧链交替出现在片层结 构的上下方，并与片层垂直。 有顺式平行、反式平行或顺反平行交替。
3、β-转角 多肽链180o回折形成的特殊结构，由4 个氨基酸残基组成，第1和第4之间形成 氢键。