植物逆境生物学基因工程

五：细胞膜脂组分
1、抗旱基因筛选
植物抗旱相关基因分为两大类: 第一类基因 编码在植物抗性中直接起保护作用的蛋白质, 属于 功能基因;
第二类基因 编码在 信号传导和逆激基因表达过程中起调 节作用的蛋白质因子, 属于调节基因。
2、抗涝基因筛选
主要针对缺氧窒息和低氧耐受以及抗 氧化
2、抗涝基因筛选
植物逆境生理 Stress Physiology
第五章 植物抗性的基因工程
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逆境及其种类 植物抗逆的生理基础 筛选抗逆基因 基因工程技术育种
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一、逆境的概念和种类
1、逆境的概念
所有对植物生命活动及生长发育不利的环 境条件，统称为逆境（stress environment)。
2、逆境种类 水分（干旱、涝渍）、 温度：[高温（热 害）、低温（寒害）]、盐碱、 环境污染
二、植物抗逆的生理基础
（一）生物膜的应变 在正常情况下，膜为液晶态。 膜中脂肪酸碳链越长，膜固化温 度越高。相同碳链长度时，不饱 和键数目越多，固化温度越低。
●膜脂饱和脂肪酸和抗旱性 呈密切正相关 ●膜脂不饱和脂肪酸直接增大 膜的流动性，提高抗冷性 ●膜脂中磷脂含量和抗冻性呈 密切正相关
（1）脯氨酸在抗逆中的作用
1.作为渗透物质，保持原生质 与环境的渗透平衡，防止失水； 2.与蛋白质结合增强蛋白质的 水合作用，增加蛋白质的可溶性 和减少可溶性蛋白质的沉淀，保 护生物大分子结构和功能的稳定。
逆境下积累的脯氨 酸主要集中在细胞质， 使细胞渗透势明显降低， 大大提高吸水能力。故 脯氨酸是细胞质渗透物 质。
,结果表明转vgb基因的油菜相比较对照在抗涝方面明显得到增强。
3、构建pBI121- MhGLB1表达载体,并对番茄进行农杆菌侵染的遗传
转化。对转基因番茄的抗涝性进行了初步检测发现:与野生型植株相 比,转基因番茄在水涝下其光合速率下降比较缓慢。（抗氧化）
3、抗寒基因筛选
动物抗冻蛋白 ( AFP)
鱼类抗冻蛋白基因转入烟草和番茄已获得较好表达 , 将人工合成的 黄盖鲽鱼抗冻蛋白基因导入玉米原生质体 ,在植物细胞中获得表达 ； 利用农杆菌将比目鱼体内抗冻蛋白 (AFP) 基因转入番茄 ,发现基因 番茄不但稳定转录 AFP 的 mRNA ,还产生一种新的蛋白质 ,这种转基 因番茄的组织提取液在冰冻条件下能有效阻止冰晶增长 ； Kimberly 等将类型 Ⅰ鱼类抗冻蛋白基因转移至烟草中并在低温下 检测到抗冻蛋白活性。
3、耐盐性相关的调控元件和因子
在拟南芥中，Pilon-Smits等报道了一批受脱水诱导的基因 Rd(Responsive to dehydration)，其中一个受脱水和低温诱导基因 rd29A的启动子中的一个9 bp的脱水响应元件(dehydration response element，DRE)，碱基序列为TACCGACAT，是一种典型的顺式作用 元件。
4、抗高温基因筛选
主要是高温抗性转录因子转化植物，提高 植物高温抗性 物高温抗性转录因子 目前已经发现的植物高温抗性转录因子有 热激转录因子、脱水应答元件结合蛋白、 MYB类转录因子、WRKY转录因子以及其它 转录因子。
1、热激转录因子：最近的研究表明，HSFs与HSPs一同组成了HSF— HSP环路，作为调节网调节热胁迫应答基因的转录激活。 2、水应答元件结合蛋白：DREB类基因的过表达能够激活热激相关 基因的表达，提高植物对高温的耐受力。预测调节高温的遗传学 级联放大反应时，DREBs和HSFs可能产生了互作。 3、 MYB类转录因子：MYB能够使植物对高温、低温、干旱及盐碱 等胁迫环境应答。 4、WRKY转录因子：。WRKy基因也广泛参与植物对高温的应答。 WRKY转录因子在基因表达过程中既是抑制物也是激活物 5、它转录因子：核转录因子X一盒结合基因1(Nuclear transcription factor X—box binding 1gene)促进获得抗热性的产生。锌指蛋白、碱 性亮氨酸拉链(basic leucine zipper，bZIP)以及多蛋白结合因子 (Multiprotein-bridging factor 1 c，MBFlc)等转录因子也积极地参与 了植物对高温胁迫的响应
CaMV 35S 启 动子的驱动下导入矮牵牛。结果预示 vhb 基因 在抗涝作 物培育 和 提高水培植物缺氧耐受能力的分子育种方面具有较良好的 应用 前景。
1、粪透明 颤 菌血 红 蛋 白 基 因（vhb） 的 编 码 区， 将 其 置于
2、已经有实验表明已经成功将明颤菌血红蛋白基因(vgb)转入油菜中
LEA蛋白基因
LEA蛋白即种子胚胎发生后期富集蛋白质，是在种子成熟和发育 阶段合成的一系列蛋白，也表达在因受干、低温和盐渍胁迫而失 水的营养组织中
COR蛋白基因
Artus 使 COR15am 多肽在转基因拟南芥中大量组成型表达后，与野 生型相比，转基因植物分别提高了叶绿体和原生质体的寒冷耐受 性并增强了原生质膜的稳定性，减轻了寒冻所造成的损伤损害。
逆境下植物体内可溶性糖和游 离氨基酸增加的原因： ☆大分子糖类和蛋白质分解加 强而合成受抑制； ☆光合产物形成过程中直接转 向低分子量的物质蔗糖等； ☆从植物其它部分输入
三、抗逆基因的筛选
抗性基因种类：
1、抗旱基因 2、抗涝基因 3、抗寒基因 4、抗高温基因 5、抗盐基因
筛选办法：
一：逆境蛋白的表达 在逆境条件下，植物的基因表达发 生改变， 启动一些与逆境相适应的基因，合成热激蛋白、 抗冻蛋白、盐胁迫蛋白等。 二：抗氧化防御系统
2、与盐胁迫信号传导有关的基因
SOS途径：5个耐盐性基因：SOSl，SOS2，SOS3，SOS4， SOS5。其中SOSl，SOS2，SOS3在一条共同SOS信号传导途 径中起作用。 钙信号途径：Urao等疆妇从损南芥中克隆蓟两个依赖钙 (Ca2+)的蛋白激酶(calmodulin-independent protein ki—nases ，CDPK)基因eDNA：cATCDPKl和cATCDPK2，并确定了其核 苷酸序列。
植物在水分胁迫下，通过代 谢活动增加溶质，提高细胞液 浓度，降低渗透势，从而降低 水势，维持吸水能力，保证正 常代谢与生长的现象，称为渗 透调节(osmoregulation or osmotic
adjustment)
2、渗透调节物质
决定细胞渗透势的可溶性 物质分为两类： ●由外界环境进入细胞内 + 的各种无机离子，如K 、Cl 等； ●细胞自身合成的有机物， 主要是脯氨酸和甜菜碱
（2）甜菜碱与植物抗逆性 甜菜碱是一种含氮化合物， 具有很高的溶解度，在生理 pH范围不带净电荷，无毒， 在逆境条件下细胞原生质中 的积累量高于液泡，可作为 细胞质渗透物质
甜菜碱的生理作用： ◎作为细胞质的解毒剂 ◎作为酶的稳定剂 ◎作为生物合成中的甲基的 供体 ◎参与磷脂的生物合成
（3）可溶性糖和游离氨基酸
●酶促防御系统 SOD、CAT、POD三者的活性协调一致，使活 性氧维持在一个低水平，这三种酶称为保护酶。 ●非酶促防御系统（抗氧化剂） VitC、VitE、GSH、Car等
三：内源激素变化 ABA与植物的抗性 乙烯与植物的抗性 四：渗透调节物质 由外界环境进入细胞内的各种无机离子，如
K+、Cl-等；细胞自身合成的有机物，主要是脯氨酸和甜菜碱 。
（二）逆境蛋白的表达 在逆境条件下，植物的基因表 达发生改变， 启动一些与逆境 相适应的基因，合成热激蛋白、 抗冻蛋白、盐胁迫蛋白等。
（三）抗氧化防御系统 逆境下植物组织通过多种途径产 生大量的活性氧(active oxygen): 例如： 超氧自由基(O-2) 羟自由基(.OH) 过氧化氢(H2O2)、 单线态氧(1O2)
（四）内源激素变化 1、ABA与植物的抗性 逆境下，植物体内游离ABA迅 速积累，含量为原来的十几倍至 几十倍。
脱落酸能提高植物的抗逆性，因为：
◆ABA能维持细胞结构和膜结构的稳定， 防止逆境对细胞器和膜系统的伤害 ◆ABA能防止水分散失，促进根系吸水 ◆ABA能改变体内代谢，促进某些物质 的积累 ◆ABA能调节植物自身的保护功能
Liu等发现属予同一个基因家族的两个转录因子基因DREBIA和 DREB2A，表达产物为DRE结合因子，结合在rd29A基因的启动子区 域，分析认为DREBlA和DREB2A是相互独立的、在分属不同的干旱 和盐胁迫信号传导途径中起着反式作用因子的作用。
四、基因工程技术育种
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AtCBF3可能通过调控许多抗性基因的表达,加强可 溶性物质的积累,提高光合性能和抗氧化能力,并减 少和清除过多的ROS,以此来提高马 铃薯的耐热性 水稻转录因子dst在调控高温下植物结实率以及植 物抗高温能力
5、抗盐基因筛选
最常见的就是在植物中过量表达抗盐相关的功能 基因,包括植物：信号传导蛋白基因、植物离子通 道蛋白基因和合成小分子渗透剂的酶基因等
增加植物体细胞内活性氧浓度的环境因素
活 性 氧 与 植 物 膜 伤 害 机 制
植物体内的防御系统能降低或消 除活性氧的攻击能力。 ●酶促防御系统 SOD、CAT、POD三者的活性协调 一致，使活性氧维持在一个低水平， 这三种酶称为保护酶。 ●非酶促防御系统（抗氧化剂） VitC、VitE、GSH、Car等。
2、乙烯与植物的抗性 植物在淹水、干旱、低温、 高温等逆境条件下，体内的乙 烯含量会迅速增加，增加的这 部分乙烯称为逆境乙烯。(stress
ethylene)
（五）渗透调节作用 1、渗透调节的概念 在水分亏缺情况下，植物要维 持正常的生理活动过程，细胞就必 _ 须具有一定的膨压。ψP=ψw ψs 当水势下降时，要维持细胞膨压不 变，只有使渗透势下降。
1、小分子渗透调节物质合成相关基因
脯氨酸：P5CS的编码基因被克隆并研究的较多：Strizhov 等发现，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中PSCS是有两个不 同基因编码的。 甜菜碱：。BADH是一个60kD的多肽二聚体，主要集中在 菠菜(Spinacia oleracea L．)和甜菜(Beta vulgarisL．)叶绿体 基质中。 可溶性糖：草杆蘩(Bacillus subtilis)中鹩果聚糖蔗糖转移酶 基因 (Sac B)研究的较多。