溶菌酶的研究及应用简介
摘要溶菌酶（lysozyme）是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶（muramidase）。人们对溶菌酶的研究始于20 世纪初，英国细菌学家Fleming在发现青霉素的前6年（1922年）发现人的唾液、眼泪中存在能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶，其中鸡蛋溶菌酶的研究和应用已相当深入和广泛［1］。通过对它的结构、性质、来源的研究；溶菌酶已广泛的应用于医药、生物工程和食品工业等多个方面。
关键词溶菌酶；结构；应用；研究进展
溶菌酶（Lysozymc EC3.2.1.17）又名胞壁质酶（muramidase）、乙酞胞壁酸聚糖水解酶（N-acctylmuramide glyca-nohydrolase）,广泛地分布于自然界[2]。在病毒（如噬菌体T4）、细菌（如枯草杆菌）、植物（如番木瓜）、动物（如鼠、狗）及人体内都含有。人体内多数组织器官含有一定浓度的溶菌酶。但以脾、肾含量较高。在鼻及支气管分泌液、泪液、脑脊液、唾液、乳汁及血液中均含有一定量的溶菌酶。此酶自被发现以来,经科学家们不断地研究,使得它在酶学及临床医学中均占有一定的重要位置，也将其应用于医疗、食品、畜牧及生物工程中。
1 溶菌酶的发现
1907年Nicollc[2]猜测芽胞杆菌（Bacillus）及枯草杆菌中含有溶解细菌的酶。1909年schtchenko[3]第一个报道了鸡蛋清内含有溶解细菌的酶。1922年Alexander Fleming[2]发现鼻粘液里有一种能溶解微球菌（micrococcus lysodeikticus）及其他细菌的酶，他把这种酶命名为溶菌酶（lysozyme）。经过仔细的观察和研究，他发现此酶广泛地存在于生物组织及机体的某些分泌物中。之后Robert及Wolff 也从鸡蛋清里提取出溶菌酶。1937~1946年间Abraham[3]，Robinson, Alderson及Fevold等人通过实验从而分别获得了溶菌酶的结晶。
2 溶菌酶的理化性质、空间结构
2.1溶菌酶的理化性质
溶菌酶由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强。当pH值为1.2～11.3范围内剧烈变化时，但其结构几乎维持不变。当pH值为4～7，96℃热处理15 min仍能保持87%的酶活性；当pH值为3 时能耐100℃加热处理45min；但碱很容易破坏酶活性，当处于碱性pH 值范围时，溶菌酶的热稳定性就很差[4]。在干燥条件下，溶菌酶可以长期在室温存放,其纯品为白色或微黄色。黄色的结晶体或无定形粉末，无臭，味甜。易溶于水，易遭碱破坏，不溶于丙酮和乙醚。其分子结构如下:
2.2 空间结构
溶菌酶是第一个结构弄清楚的酶，在很长一段时间中,其中有许多蛋白晶体研究及蛋白质结构与功能关系研究。这些进展都是利用溶菌酶获得的溶菌酶一直被当作一种研究蛋白质空间构象、酶动力学及分子进化的理想模型[5]。溶菌酶的分子最较小，不同来源的溶菌酶组成一级结构的氨基酸数量是相同的，但多肽链上某些个别氨基酸有差异，因此来源于不同种属如噬菌体、番木瓜、鸟类、鸡、鼠、狗、人类的溶菌酶或同一种属不同脏器如兔的肝、脾、鼠的脾、肾的溶菌酶分子量各不相同[1][3],鸡蛋清溶菌酶的分子量为14000[8]。目前，鸡蛋清溶菌酶HEWL 的酶学性质、分子结构、催化机理乃至酶蛋白基因结构已研究清楚，并成为研究蛋白质结构与功能的一个重要模式蛋白。1963年J.Jollcs和Canfields 测定了鸡蛋清溶菌酶HEWL的一级结构。Phillips 等人1965年用x 射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构，HEWL由129个氨基酸残基组成的单一多肤链，含有4对二硫，三维结构为一较紧密的椭球，大小为4.5 nm×3.0 nm×3.0 nm，其构象复杂，α螺旋仅占25 %，在分子的一些区域有伸展着的β片层结构，研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的, 疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构
象中起到重要作用, 其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙, 这是溶菌酶的活性部位。溶菌酶的底物为细胞壁的长链肽聚糖，当酶发挥催化效力时，肽聚糖的六个氨基糖单位正好嵌入酶的裂隙，裂隙两侧为Glu35、Asp52 及Trp62 残基是酶活性必需基团；同时Asp101、A rg114、Trp108等残基对“底物—酶复合物”的形成也起着重要作用，该酶活性受组氨酸和N-乙酰葡糖胺的抑制。
后期的研究表明，不同来源的溶菌酶虽在空间结构相似但在活性中心与功能上是有所不同。植物溶菌酶活性中心的研究比较少，木瓜溶菌酶中Trp残基不参与底物的结合，活性中心除包括—COOH (Asp / Glu)外，还必需一个Cys。而且，该酶受组胺抑制基本上不受N-乙酰葡糖胺抑制，这些与HEWL 有所不同。
赖晓芳[6]等采用化学修饰等方法，对萝卜溶菌酶活性中心进行了初步研究，他们采用脱氨再生几丁质凝胶亲和层析从萝卜叶中获得了PAGE均一的溶菌酶，并通过微量蒸发扩散法获得其结晶。用pH 动力学研究方法和化学修饰法对酶的活性中心进行了初步研究。实验结果表明: —COOH ( Glu/A sp)基团、Trp 及His残基可能为酶活性所必需。对Tyr、Cys、Ser/ Thr残基修饰后，酶活性基本上不受影响。同时，酶活性受到组胺和N-乙酰葡糖胺抑制。并且对萝卜溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶和木瓜溶菌酶的活性中心的相互差异进行了讨论。现有情况表明萝卜溶菌酶活性中心与HEWL 可能不同，HEWL 的活性中心只包括—COOH (Asp/Glu)和Trp残基；亦与木瓜溶菌酶的不同，其活性中心除含—COOH (Glu/Asp)基团外，还含有—SH基团。用IAA 和DTNB 对萝卜溶菌酶进行化学修饰，酶活性基本不变，用EIIman试剂法也测不出酶分子含有游离—SH基团，只测得酶分子中含有2.11mol—SH蛋白质的二硫键存在，所以萝卜溶菌酶活性中心可能不含游离巯基。另外，HEWL，受组胺和N-乙酰葡糖胺显著抑制；而萝卜溶菌酶也受组胺显著抑制，但基本上不受N-乙酰葡糖胺抑制；木瓜溶菌酶不仅受组胺显著抑制，而且受N-乙酰葡糖胺抑制也较强。这些差异可能反应了萝卜溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶和木瓜溶菌酶在功能上的分化。
3 溶菌酶的种类及作用机理
溶菌酶根据其作用的微生物不同可以分为两大类：细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。胞壁溶菌酶又细分为两种：一种是作用于β-1, 4糖苷键的细胞壁
