中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》 2

左卡尼汀注射液细菌内毒素检查方法的研究概述：左卡尼汀，是一种广泛存在于机体组织内的氨基酸，其重要功能是促进其氧化分解，为细胞提供能量，促进脂类代谢。

临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛、心律失常，亦可作为治疗血液透析患者的辅助药物。

目前《中国药典》2010年版并未收录该品种。

也尚无国家标准对其进行细菌内毒素检查。

因此，参照《中国药典》2010年版二部附录收载的细菌内毒素检查法，对本品进行了细菌内毒素检查的方法研究。

1．验证目的1.1 考察鲎试剂的灵敏度是否准确；1.2 考察检验人员的操作方法是否准确及试验条件是否符合规定；1.3 检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素有无干扰作用。

2．验证要求为确保细菌内毒素检验结果的准确可靠，当建立产品的细菌内毒素检查时，需确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。

并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性时供试品是否存在干扰作用。

由于干扰试验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂灵敏度无关，因此在干扰实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。

3．验证材料及设备3.1 样品信息3.1.1 样品名称:左卡尼汀注射液3.1.2 批号：10100901、10101001、101011013.1.3 规格：5ml:1g3.2 仪器与试药3.2.1 仪器:ET-96内毒素凝胶法测定仪；ZH-2型自动漩涡混合器。

3.2.2 试药:细菌内毒素工作标准品(规格：每支10 EU，批号：1007010，湛江博康海洋生物有限公司)；细菌内毒素检查用水(BET 水，规格：每支5ml，批号：100507，湛江博康海洋生物有限公司)；鲎试剂A(TAL，规格：每支0.1ml，批号：1002031、1005100，灵敏度分别为:0.250、0.500 EU／ml，湛江博康海洋生物有限公司)；鲎试剂B(TAL，规格：每支0.1ml，批号:100802，灵敏度为:0.500EU ／ml，厦门市鲎试剂实验厂有限公司)；左卡尼汀注射液(规格：5ml:1g，批号：10100901、10101001、10101101)。

细菌内毒素工作标准品检验操作规程部门质量控制部题目细菌内毒素工作标准品检验操作规程起草审阅批准共2页编号 HY/02—ZK—203 执行日期页码第1页细菌内毒素工作标准品检验操作规程一、范围:本标准规定了细菌内毒素工作标准品的测定方法和操作要求;适用于本公司细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素质控品的质检测定。

二、引用标准:2010年版《中国药典》附录“细菌内毒素检查法"三、要求：1、操作环境：温度不得高于26？，湿度不得高于75％;2、标准品:细菌内毒素国家标准品.五、操作步骤:3(效价测定以国家标准品为基准,随机取本品2支，使用同一批鲎试剂参考品测定，2支反应终点的均值应与国家标准品的效价相平行或一致。

3。

1 凝胶法3。

1.1 根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)，将细菌内毒素国家标准品用检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成4个浓度的标准内毒素溶液，即2λ、λ、0.5λ和0。

25λ备用，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。

3.1.2 设待复核的细菌内毒素工作标准品效价为P，用1ml检查用水溶解,在旋涡混合器上混合15分钟,然后制备成6个浓度的内毒素溶液，即（P/4λ)倍、(P/2λ)倍、（P/λ）倍、(2P/λ）倍、(4P/λ)倍和（8P/λ）倍备用,每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。

3。

1。

3 细菌内毒素国家标准品和细菌内毒素工作标准品稀释须同时进行.3.1.4 按《细菌内毒素检查法》项下操作，每一个内毒素浓度平行做4管。

如细菌内毒素国家标准品和细菌内毒素工作标准品的最大浓度4管均为阳性，最低浓度4管均为阴性，按下式计算细菌内毒素国家标准品反应终点浓度的几何平均值（E）和细菌内毒素工作标准品反应终点浓度对应的稀释倍数的几何平均值（D).-1其中E=1g(?X/4）式中 X为细菌内毒素国家标准品反应终点浓度的对数值（1g）;—1D=1g(?X/4) 1式中 X为细菌内毒素工作标准品反应终点浓度对应的稀释倍数的对数值（1g). 1则待复核细菌内毒素工作标准品的效价的测定值为Pc=E×D。

门冬氨酸鸟氨酸注射液细菌内毒素检查法的研究目的建立门冬氨酸鸟氨酸注射液细菌内毒素检查方法。

方法按《中国药典》2010年版二部附录细菌内毒素检查法，采用2个不同厂家的鲎试剂对门冬氨酸鸟氨酸注射液进行研究。

结果根据临床实际应用情况，确定门冬氨酸鸟氨酸注射液的内毒素限值L = 10 EU/mL；本品稀释20倍以后，对细菌内毒素检查无干扰；按拟定标准检验，该品种2个厂家6批样品细菌内毒素检查结果和家兔热原检查结果均符合规定。

结论细菌内毒素检查法可代替家兔热原检查法用于门冬氨酸鸟氨酸注射液的质量控制。

标签：门冬氨酸鸟氨酸注射液；细菌内毒素检查；干扰试验门冬氨酸鸟氨酸注射液为肝胆疾病辅助用药，临床上主要用于因急、慢性肝病（如各型肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝炎后综合征）引发的血氨升高及治疗肝性脑病，尤其适用于治疗肝昏迷早期或肝昏迷期的意识模糊状态。

国内市场上已有本品的进口药品，目前尚无国内药厂的门冬氨酸鸟氨酸注射液上市。

门冬氨酸鸟氨酸注射液的国家食品药品监督管理局进口药品注册标准采用家兔法进行热原检查，本实验根据《中国药典》2010年版二部“细菌内毒素检查法”[1]99-101和“化学药品注射剂安全性检查法应用指导原则”[1]212-213，以及相关细菌内毒素检查的文献[2-12]，对门冬氨酸鸟氨酸注射液应用鲎试剂进行细菌内毒素检查的可行性进行了研究并建立了门冬氨酸鸟氨酸注射液的细菌内毒素检查方法。

1 仪器与试药1.1 仪器VS-1300L-U洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司），S648 恒温水浴锅（上海医疗器械七厂），XW-80A混旋仪（上海沪西分析仪器厂有限公司），微量取液器（50～250 μL，上海荣泰生化工程有限公司），细菌内毒素检查用具（湛江博康海洋生物有限公司），智能热原仪（天津大学无线电厂精密仪器厂，ZRY-2D型）。

1.2 细菌内毒素检查用水细菌内毒素检查用水（福州新北生化工业有限公司，批号：11102021，规格：100 mL/瓶）。

细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于《中国药典》2010年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。

后者包括浊度法和显色基质法。

供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。

当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中或国家标准有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L＝K∕M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U等表示。

K为按规定的给药途径，人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(kg·h) 表示。

其中注射剂，K＝5EU／(kg·h)；放射性药品注射剂，K＝2.5EU／(kg·h)；鞘内用药品，K＝0.2EU／(kg·h)。

M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml／(kg·h)、mg／(kg·h)、U／(kg·h) 等表示。

药品人用最大剂量可依据药品使用说明书或参阅《临床用药须知》，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1h的按1h计。

若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量［即M：（最大给药剂量／(m２·h)×1.62m２）／60kg］。

1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：MVD＝C·L／λL为供试品的细菌内毒素限值，当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／u表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／ml或U／ml。

λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。

供试品如为无菌粉末或原料药，供试品最小有效稀释浓度（MVC）按下式计算：MVC＝λ／L。

细菌内毒素检测标准一、范围：本试验为《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中规定的“凝胶法”，系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理，经判定供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。

二、依据：GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法。

第二部分：生物学试验方法。

《中华人民共和国药典》2010年版二部三、器具及试剂：1.器材：（1）锥形瓶（2）三角烧瓶（3）无热原剪刀、镊子（4）恒温培养箱（5）超净工作台（6）恒温水浴箱（7）电热干燥箱（8）旋涡混合器（9）移液器2.试剂：（1）细菌内毒素国家标准品（2）细菌内毒素工作标准品（3）鲎试剂（4）细菌内毒素检查用水四、实验前准备：1.器具处理：试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素。

玻璃器皿置电热干燥箱内1800C干烤至少2h，或2500C干烤至少30min。

塑料器皿置30%双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒检查用水充分冲洗后置600C烘干备用。

2.鲎试剂灵敏度复核实验：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度试验。

试验步骤按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中规定进行。

3.供试品干扰实验：（1）对未知或可疑的供试品初次进行细菌内毒素试验之前应先进行干扰试验，以检验供试品对细菌内毒素试验是否有抑制或增强作用，以及其他影响细菌内毒素试验准确性和敏感性的干扰作用。

当鲎试剂、供试品来源、供试品配方或生产工艺有变化或其他任何影响细菌内毒素试验结果的试验条件改变时，应重新进行干扰实验。

（2）每种产品应取3批并分别使用不少于两个制造商生产的鲎试剂进行干扰实验。

供试液制备按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”规定进行。

（3）如供试品对细菌内毒素试验有干扰作用，可选用下列适宜方法排除干扰：a)使用更灵敏的鲎试剂对供试品进行更大倍数稀释;b)采用无热原氨基甲烷缓冲液稀释供试液;c)采用无热原氢氧化钠或盐酸溶液调节供试液pH值在6.0-8.0范围;d)采用阳离子缓冲（MgSO4或MgCl2）稀释供试液以调节离子浓度。

细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。

后者包括浊度法和显色基质法。

供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。

当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中或国家标准有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L＝K∕M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U等表示。

K为按规定的给药途径，人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(kg·h) 表示。

其中注射剂，K＝5EU／(kg·h)；放射性药品注射剂，K＝2.5EU ／(kg·h)；鞘内用药品，K＝0.2EU／(kg·h)。

M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml／(kg·h)、mg／(kg·h)、U／(kg·h) 等表示。

药品人用最大剂量可依据药品使用说明书或参阅《临床用药须知》，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1h的按1h计。

若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量［即M：（最大给药剂量／(m２·h)×1.62m２）／60kg］。

1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：MVD＝C·L／λL为供试品的细菌内毒素限值，当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L 的单位以EU／mg或EU／u表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／ml 或U／ml。

λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。

供试品如为无菌粉末或原料药，供试品最小有效稀释浓度（MVC）按下式计算：MVC＝λ／L。

审批及颁发：会审：分发：一、目的为确保注射用重组人生长激素药品细菌内毒素检测方法在实验条件下不对内毒素和鲎试剂的反应存在干扰作用，以保证检测结果可符合质量标准要求，特对本品细菌内毒素检测方法学进行研究并制定此验证方案。

二、范围注射用重组人生长激素药品细菌内毒素验证方案三、职责验证组织及人员职责四、术语无五、内容1 概述注射用重组人生长激素是我公司的主打产品，其属于注射剂类里面的注射用无菌粉末。

根据《中国药典》2010年版的要求，本产品需对细菌内毒素检查方法学进行验证，为了确定注射用重组人生长激素在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据，特制定本方案。

验证结果应显示在规定浓度下的注射用重组人生长激素对内毒素和鲎试剂的反应无干扰作用。

2 验证项目3 验证时间安排1. 2012年10月01日至 2012 年10月15日制订、审核及批准验证方案；2. 2012年10月16日至 2012 年11月 05日验证确认3. 2012年11月05日至 2012年11月 10日写出验证报告4、验证前提条件确认4.1 相关文件及人员培训确认4.1.1 相关文件确认结论: 检查人/日期：复核人/日期：4.1.2 方法确认人员确认结论: 检查人/日期：复核人/日期：4.2 验证用仪器仪表和物品有效性确认见附录3检查结果：检验人/时间：复核人/日期：4.3 鲎试剂灵敏度复核4.3.1 实验材料及用具4.3.1.1 进行细菌内毒素干扰试验验证前，所有的器具须经250℃干烤30 分钟以上，若使用塑料器械，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

4.3.1.2 器具：移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮、旋涡混合器。

4.3.1.3 细菌内毒素工作标准品，系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

比武试题九一、填空1．抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。

2．在抗生素微生物检定法中，二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径应在 18～22 ㎜。

3．在抗生素微生物检定法中，实测效价与估计效价：试验计算所得效价应在估计效价的±10% 以内。

4．抗生素微生物检定法常用检定菌为枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和藤黄微球菌。

5．抗生素微生物检定法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。

6．《中国药典》2010年版细菌内毒素检定法分凝胶法和光度测定法；后者包括浊度法和显色基质法。

7．凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于 0.015 EU/ml的灭菌注射用水。

光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素含量小于 0.005 EU/ml。

8．当细菌内毒检查测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。

9．无菌检查应在环境洁净度 10000 级下的局部洁净度 100 级的单向流空气区域或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

10．药品进行无菌检查时所用的冲洗液有0.1％蛋白胨水溶液和pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。

11．无菌检定法有薄膜过滤法和直接接种法两种方法；细菌培养温度为32.5℃±2.5℃，真菌培养温度为25.5℃±2.5℃。

12．培养基灵敏度检查所用菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。

13.洁净室的温度和相对湿度应与药品生产工艺要求相适应。

无特殊要求时，温度应控制在18～26℃，相对湿度控制在45%～65%。

14．眼部给药制剂微生物限度检查除细菌数、霉菌数和酵母菌数外还包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌。

15．微生物限度检查中，细菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃；控制菌培养温度为35～37℃。